偽狂犬病病毒Qihe547分離株全基因組測(cè)序分析.pdf

1、豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬的急性致死性傳染病。PR廣泛分布于世界各國(guó)，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的一種最為嚴(yán)重的病毒性疾病，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。
　　20世紀(jì)90年代以來(lái)通過(guò)基因缺失疫苗的廣泛使用及鑒別診斷方法的應(yīng)用使PR在我國(guó)豬場(chǎng)得到有效控制，但自2011年底以來(lái)，我國(guó)多省份的免疫Bartha-K61疫苗的豬場(chǎng)陸續(xù)暴發(fā)PR，山東各地區(qū)免疫Ba

2、rtha-K61疫苗的豬場(chǎng)也相繼發(fā)生PR，造成母豬繁殖障礙，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高死亡率。2014年11月份至2015年3月，本研究從山東4個(gè)地區(qū)的5個(gè)疑似PR發(fā)病的規(guī)?；i場(chǎng)采集的病料樣品中分離多株P(guān)RV野毒株，對(duì)其中分離自山東齊河地區(qū)的PRV毒株進(jìn)行了全基因組測(cè)序及遺傳變異分析。
　　1、豬偽狂犬病病毒分離和鑒定
　　2014年11月份至2015年3月，樣品采集自山東濟(jì)南、齊河、沂水、費(fèi)縣4個(gè)地區(qū)5個(gè)疑似PR發(fā)病豬場(chǎng)。

3、將組織樣品勻漿，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)，確定為PRV野毒感染。組織勻漿上清過(guò)濾除菌，接種到PK15細(xì)胞上，接種約8h細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)變圓、合胞體等典型病變。分離病毒經(jīng)蝕斑純化，在PK15細(xì)胞上連續(xù)傳代增殖，并提取收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液的DNA，使用gE基因特異性引物鑒定顯示所分離的PRV毒株為野毒株。將分離5株P(guān)RV分別命名為Qihe547、SDYS1、SDYS2、SDFX、SDJN，其中Qihe547株在PK15細(xì)胞上TCID50達(dá)到10-

4、7.0/0.1ml。將PRV分離株細(xì)胞培養(yǎng)液接種體重2㎏母兔出現(xiàn)奇癢、啃咬接種部位、尖叫等典型臨床癥狀，并很快死亡。
　　2、Qihe547分離株全基因組測(cè)序
　　本研究根據(jù)PRV Becker（JF797219）全基因組序列先后共設(shè)計(jì)200多對(duì)引物，每對(duì)引物之間均包含重疊序列。以提取的PRV Qihe547株DNA為模板，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。將各片段序列拼接，得到全長(zhǎng)為143404bp的Qihe547基因組序列，

5、并對(duì)全基因組中的基因進(jìn)行了定位和注釋。
　　3、Qihe547分離株基因組中各基因的比對(duì)分析
　　為了解Qihe547株基因組中各基因的變異情況，我們對(duì)Qihe547株的全基因組序列與GenBank中登陸的PRV全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析并篩選各基因序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析?；赒ihe547株全基組序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Qihe547株與國(guó)內(nèi)PRV分離株的同源性高于其與國(guó)外PRV分離株的同源性，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中其與國(guó)內(nèi)其他P

6、RV分離株處于獨(dú)立分支中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Qihe547株屬目前PRV基因分型中的基因Ⅱ型。我們對(duì)Qihe547株的主要的保護(hù)性抗原基因gB、gC、gD基因進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)對(duì)gB、gC、gD的糖基化位點(diǎn)和抗原表位進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Qihe547分離株gB、gC、gD的氨基酸序列中均存在氨基酸的插入或缺失，gB75SPG773個(gè)氨基酸的缺失，94G的插入；gC63AAASTPA697個(gè)氨基酸的插入；gD278RP2792個(gè)氨基酸的插入。與Ba

7、rtha株相比，Qihe547分離株在gB的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)(aa59~aa126)、gC膜外區(qū)（aa23~aa453）和gD主要抗原表位區(qū)，潛在的抗原位點(diǎn)及潛在O-糖基化位點(diǎn)存在明顯變異，推測(cè)這些變異可能影響Qihe547分離株的抗原性，可能利于病毒逃避宿主免疫反應(yīng)。對(duì)Qihe547株基因組中其他結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的氨基酸序列中存在不同程度的變異，其中與PRV復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白基因的變異較大。對(duì)