野生茄子StPP5和StLTPa7基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、黃萎病是由大麗輪枝菌侵染引起的茄子主要病害，我國(guó)大部分茄子產(chǎn)區(qū)均遭受黃萎病的影響，選育和種植抗病品種是控制黃萎病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。
　　 本研究從大麗輪枝菌誘導(dǎo)的抗病野生茄子托魯巴姆基因差異表達(dá)cDNA文庫(kù)中挑選5型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因StPP5和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPa7的TDFs作為研究對(duì)象，采用同源克隆法擴(kuò)增這兩個(gè)基因，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的煙草植株，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株黃萎病的抗性進(jìn)行初步分析。

2、主要研究結(jié)果如下：
　　 1)采用RT-PCR方法克隆了茄子5型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶StPP5的cDNA序列，該基因序列含有一個(gè)1458 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼由485個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，分子量為54.63 kDa，理論等電點(diǎn)為5.66.將該cDNA全長(zhǎng)序列提交NCBI，登錄號(hào)為JF421125。StPP5蛋白N端具有 TPR家族結(jié)構(gòu)域，C端具有PP2C型蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析顯示StPP5有較高的基礎(chǔ)表達(dá)，水楊酸與大

3、麗輪枝菌侵染增加其表達(dá)，在24 h葉中表達(dá)量達(dá)到最高，之后隨時(shí)間推移而降為本底水平。
　　 2)采用 RT-PCR方法克隆了茄子非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因StLTPα7的cDNA序列，該序列含有一個(gè)345 bp的開(kāi)放閱讀框，推測(cè)編碼為114個(gè)氨基酸的蛋白，相對(duì)分子量為11.42 KD，理論等電點(diǎn)為9.01.將該cDNA全長(zhǎng)序列提交NCBI，登錄號(hào)為JF421126。StLTPa7蛋白含有AAI-LTASS家族結(jié)構(gòu)域，為nsLTP1

4、所特有的蛋白家族。表達(dá)分析顯示StLTPα7在未處理的野生茄子莖和葉子中表達(dá)量極低，幾乎不表達(dá)。大麗輪枝菌處理后，StLTPα7在莖中表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而增加，在24 h表達(dá)量達(dá)到最高，隨后逐步下降為本底水平，該基因主要在葉中表達(dá)。
　　 3)以pCAMBIA1304為載體，構(gòu)建了StPP5和StLTPα7兩個(gè)基因的過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1304-StPP5和pCAMBIA1304-StLTPα7。通過(guò)農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化煙