野生金蕎麥類異黃酮還原酶基因（FcIRL）的克隆與功能的初步研究.pdf

1、野生金蕎麥[Fagopyrum cymosum(Trev.)Meisn]是蓼科(Fagopyrum)蕎麥屬(Polygonaceae)多年生草本植物，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富且具有重要藥用價(jià)值的資源植物，其塊根活性提取物具有顯著的抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及抗菌消炎等重要作用。但是目前對(duì)野生金養(yǎng)麥的研究還主要的集中在營(yíng)養(yǎng)成分與化學(xué)成分分析、藥效學(xué)研究和抗癌機(jī)制研究上，而對(duì)于藥效成分及相關(guān)代謝途徑基因的研究還報(bào)道的不多。到目前為止，野生金養(yǎng)麥次

2、生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的研究還僅限于二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控岡子P基因的克隆及其功能的初步驗(yàn)證。其他的功能基因和調(diào)控基因等還未見有研究報(bào)道。 為了進(jìn)一步的研究金蕎麥藥物的次生代謝途徑，我們采用RACE與cDNA文庫結(jié)合的方法首次從野生金養(yǎng)麥中分離克隆到了可能的類異黃酮還原酶基因(FcIRL基因)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和功能的初步預(yù)測(cè)，構(gòu)建了正義表達(dá)

3、載體，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化模式植物煙草與矮牽牛的研究。 FcIRL基因的cDNA(accession no．EU116032)全長(zhǎng)1217bp，含有1個(gè)942 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼313個(gè)氨基酸。其5’UTR區(qū)含有2個(gè)終止子TAG，3’UTR區(qū)含有推測(cè)的加尾信號(hào)ATAAA和polyA尾巴，對(duì)應(yīng)基因組序列不含內(nèi)含子。FcIRL蛋白N端含有1個(gè)N-乙?；饔梦稽c(diǎn)(M1-K5)和1個(gè)保守的NA

4、DPH結(jié)合位點(diǎn)(G10-G-T-Gt3-Y-I-G16)，具有1個(gè)保守的NmrA(nitrogen metabolite repression regulator)結(jié)構(gòu)域(V6-N244)和多個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)．以及1個(gè)保守的N-糖基化作用位點(diǎn)(N214)。序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)生分析以及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析均表明，F(xiàn)cIRL蛋白屬于松脂醇．落葉松脂醇還原酶(pinoresinol-lariciresinol reductase，PL

5、R)類，推測(cè)其具有PLR的生物活性，是8-8'連接木脂素(8-8’linked lignans)合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化松脂醇和落葉松脂醇還原生成開環(huán)異落葉松脂(secoisolariciresinol)，參與金蕎麥藥用次生代謝與植物的防御。成功構(gòu)建了野生金養(yǎng)麥FcIRL基因正向表達(dá)載體pC2301-FcIRL,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將FcIRL基因?qū)肽Ｊ街参餆煵菖c矮牽牛中。通過抗性篩選、報(bào)告基因GUS活性組織化學(xué)染色篩選及PCR檢測(cè)，