野生金蕎麥類異黃酮還原酶基因（FcIRL）的克隆與功能的初步研究.pdf

1、野生金蕎麥[Fagopyrum cymosum(Trev.)Meisn]是蓼科(Fagopyrum)蕎麥屬(Polygonaceae)多年生草本植物，是一種營養(yǎng)豐富且具有重要藥用價值的資源植物，其塊根活性提取物具有顯著的抗癌、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及抗菌消炎等重要作用。但是目前對野生金養(yǎng)麥的研究還主要的集中在營養(yǎng)成分與化學成分分析、藥效學研究和抗癌機制研究上，而對于藥效成分及相關代謝途徑基因的研究還報道的不多。到目前為止，野生金養(yǎng)麥次

2、生代謝途徑中關鍵酶基因的研究還僅限于二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控岡子P基因的克隆及其功能的初步驗證。其他的功能基因和調(diào)控基因等還未見有研究報道。 為了進一步的研究金蕎麥藥物的次生代謝途徑，我們采用RACE與cDNA文庫結合的方法首次從野生金養(yǎng)麥中分離克隆到了可能的類異黃酮還原酶基因(FcIRL基因)，并對其進行生物信息學的分析和功能的初步預測，構建了正義表達

3、載體，并進行了轉(zhuǎn)化模式植物煙草與矮牽牛的研究。 FcIRL基因的cDNA(accession no．EU116032)全長1217bp，含有1個942 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼313個氨基酸。其5’UTR區(qū)含有2個終止子TAG，3’UTR區(qū)含有推測的加尾信號ATAAA和polyA尾巴，對應基因組序列不含內(nèi)含子。FcIRL蛋白N端含有1個N-乙?；饔梦稽c(M1-K5)和1個保守的NA

4、DPH結合位點(G10-G-T-Gt3-Y-I-G16)，具有1個保守的NmrA(nitrogen metabolite repression regulator)結構域(V6-N244)和多個重要的磷酸化位點．以及1個保守的N-糖基化作用位點(N214)。序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)生分析以及蛋白質(zhì)高級結構預測分析均表明，F(xiàn)cIRL蛋白屬于松脂醇．落葉松脂醇還原酶(pinoresinol-lariciresinol reductase，PL

5、R)類，推測其具有PLR的生物活性，是8-8'連接木脂素(8-8’linked lignans)合成途徑中的關鍵酶，催化松脂醇和落葉松脂醇還原生成開環(huán)異落葉松脂(secoisolariciresinol)，參與金蕎麥藥用次生代謝與植物的防御。成功構建了野生金養(yǎng)麥FcIRL基因正向表達載體pC2301-FcIRL,用農(nóng)桿菌介導的葉盤法將FcIRL基因?qū)肽Ｊ街参餆煵菖c矮牽牛中。通過抗性篩選、報告基因GUS活性組織化學染色篩選及PCR檢測，