人TALL-1基因的克隆、表達(dá)和生物學(xué)活性研究.pdf

1、人類基因組計劃將基因組學(xué)推向了生物醫(yī)學(xué)研究的最前沿.基因組學(xué)研究的進(jìn)展又將由之產(chǎn)生的新的生物技術(shù)推向了世界經(jīng)濟(jì)的前沿.在這個時代,基因組藥物具有巨大的開發(fā)潛力.迄今為止至少有19個腫瘤壞死因子(TNF)超家族和29個腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員被發(fā)現(xiàn),它們作為機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一類重要的細(xì)胞因子,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫反應(yīng)、炎癥等一系列生理和病理反應(yīng)過程中均具有非常重要的調(diào)控作用.研究的主要實驗方法及結(jié)果如下:1、通過生物信

2、息學(xué)分析設(shè)計合成引物,采用RT-PCR技術(shù)從人新鮮淋巴結(jié)組織中克隆獲得編碼TALL-1基因全長及其可溶性部分的基因編碼區(qū)cDNA,將其克隆入有α因子分泌信號肽的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC-9K中,并進(jìn)行了序列測定.2、將表達(dá)載體采用單交換的整合方式電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115(Mut+),篩選高拷貝重組轉(zhuǎn)化子,通過對甲醇誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,表達(dá)量有所提高但仍然不夠理想,SDS-PAGE分析未見明顯的目的蛋白條帶,分泌上清中總蛋白含量

3、測定在d4-d5達(dá)到高峰,采用RT-PCR和3'RACE方法從轉(zhuǎn)錄水平檢測到轉(zhuǎn)化子中目的基因的轉(zhuǎn)錄,Western blot和ELISA檢測結(jié)果顯示,濃縮后的表達(dá)上清中確實含有目的蛋白,上述結(jié)果證實了目的基因在P.pastoris畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的可行性,并且表達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)活性和抗原性,同時由于采用的是具有中和活性的單抗,二者發(fā)生反應(yīng)一定程度上說明分泌上清中的目的蛋白具有hTALL-1的生物活性,在此基礎(chǔ)上利用MTT

4、方法檢測到分泌上清的濃縮凍干產(chǎn)物對Hela細(xì)胞的生長有抑制效應(yīng),進(jìn)一步證實分泌上清中的目的蛋白具有hTALL-1的生物學(xué)活性.3、將目的基因亞克隆到pGEX-4T-1質(zhì)粒,測序證實后轉(zhuǎn)染BL21大腸桿菌,篩選獲得含多拷貝基因的高表達(dá)株,以IPTG誘導(dǎo)其高效表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件,初步探索sTALL-1基因工程表達(dá)的條件,建立sTALL-1原核表達(dá)基因工程菌株,并用耦聯(lián)有谷胱甘肽的GSTrap親和層析純化,凝血酶柱上切割獲得sTALL-1蛋白

5、,SDS-PAGE和Western blot檢測純化蛋白.4、在細(xì)胞和分子水平初步進(jìn)行sTALL-1的功能研究，結(jié)果表明表達(dá)蛋白sTALL-1與抗IgM共同刺激B淋巴細(xì)胞，可使B淋巴細(xì)胞達(dá)到不同程度的增殖;在抗CD3單抗作用的基礎(chǔ)上，加用表達(dá)蛋白sTALL-1可明顯增強(qiáng)抗CD3單抗對T淋巴細(xì)胞的刺激作用;應(yīng)用MTT比色法發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物sTALL-1蛋白對A549、Hela、H446和U937細(xì)胞具有明顯的生長抑制效應(yīng)，凋亡率從41.4﹪

6、～72.5﹪.此外，caspase-3活性測定顯示sTALL-1可激活腫瘤細(xì)胞中caspase-3的活化，引起PARP降解，表明其對腫瘤的生長抑制作用是通過凋亡誘導(dǎo)所致.5.為了獲得肽鏈更短而生物學(xué)活性更強(qiáng)或者不變的突變體，我們利用已知的sTALL-1及其受體的晶體結(jié)構(gòu)信息從理論上對sTALL-1進(jìn)行了缺失突變，得到了兩個突變體，采用折疊辨識法對突變體分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行了mTALL-1A和mTALL

7、-1B的基因擴(kuò)增并測序證實.6、將得到的突變體基因片段克隆到pGEX-4T-1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BL21大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的高效表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析證實獲得了GST-mTALL-1A和GST-mTALL-1B重組蛋白，利用具有中和活性的hTALL-1單抗進(jìn)行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)可以和GST-mTALL-1A蛋白粗提物發(fā)生反應(yīng)，這在一定程度上說明GST-mTALL-1A具有hTALL-1的生物活性;