抗鞘翅目Bt殺蟲(chóng)基因GFM cry3Bb的人工合成、原核表達(dá)及植物轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、鞘翅目通稱(chēng)甲蟲(chóng),全世界已知約33萬(wàn)種,中國(guó)已知約7000種.鞘翅目是昆蟲(chóng)綱中乃至動(dòng)物界種類(lèi)最多、分布最廣的第一大目.鞘翅目昆蟲(chóng)是近年來(lái)危害越來(lái)越嚴(yán)重的植物害蟲(chóng),字身披鞘殼,繁殖速度快,化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治難度較大.常規(guī)育種由于受到種質(zhì)資源稀少的限制,目前還未很好解決抗鞘翅目害蟲(chóng)的育種問(wèn)題.利用基因工程技術(shù)把具有殺鞘翅目活性的Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入植物,培育抗鞘翅目新品種是控制其危害的一條新途徑.大量的研究表明,將野生型Bt基因直接轉(zhuǎn)入到植物

2、中,表達(dá)量很低甚至不表達(dá),而不具有抗蟲(chóng)的實(shí)際效果.該研究有目的地利用植物的偏好密碼子對(duì)原始Bt基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,調(diào)整并去除會(huì)影響mRNA穩(wěn)定的序列元件,以期獲得高抗鞘翅目并適合于在植物中高效表達(dá)的新基因,為培育抗鞘翅目昆蟲(chóng)的作物品種打下基礎(chǔ).其主要工作結(jié)果如下:1.設(shè)計(jì)并人工合成Bt GFMcry3Bb殺蟲(chóng)基因.在保證野生型基因氨基酸序列不變的前提下,用植物的偏好密碼子對(duì)核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化,去掉了原有基因的44處PPSS信號(hào)序列和4處

3、ATTTA序列,AT富集區(qū)(≥5個(gè)A/T)也由野生型的47處減少到改造后的4處.使G+C含量由原來(lái)的32.96﹪提高到49.43﹪,達(dá)到了植物基因的GC含量水平.改造后的基因與天然的cry3Bb基因保持了74﹪的核苷酸序列同源性,總共修改了725個(gè)密碼子中的477個(gè),改變幅度達(dá)到65.8﹪.用連續(xù)延伸PCR法擴(kuò)增出了全長(zhǎng)的基因,克隆到通用載體pBluescript Ⅱ SK上,測(cè)序結(jié)果和預(yù)期設(shè)計(jì)的序列完全一致.2.構(gòu)建了該殺蟲(chóng)基因的原核

4、表達(dá)載體pGEX-GFMcry3Bb,在E.coli中獲得了高效表達(dá)的融合蛋白,并利用親和層析的方法成功地對(duì)其進(jìn)行了純化,純化的蛋白大小與預(yù)期一致.3.利用純化的cry3Bb蛋白進(jìn)行兔免疫,得到相應(yīng)的多克隆抗體,經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)其效價(jià)為1:8000,可以用于轉(zhuǎn)基因植物的ELISA法檢測(cè).4.構(gòu)建了人工合成的GFMcry3Bb基因的雙子葉植物表達(dá)載體pGeneral-GFMcry3Bb.5.通過(guò)轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)GFMcry3Bb基因的