PTD對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的增效和克抗分子機(jī)理研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。編碼Bt殺蟲蛋白的基因也作為最主要的殺蟲基因轉(zhuǎn)入到了多種重要的糧棉作物中，在害蟲防治中起著巨大的作用，但目前害蟲對(duì)Bt的抗藥性已日趨嚴(yán)重。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)是十字花科蔬菜的主要害蟲，也是至今唯一在田間發(fā)現(xiàn)已對(duì)Bt產(chǎn)生抗性種群的害蟲。 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Prote

2、intransductiondomain，PTD)是一類能自動(dòng)穿透細(xì)胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)的一段富含精氨酸的多肽。本研究利用TAT(一種PTD)作為載體攜帶生物大分子透過細(xì)胞膜的能力，在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的TAT-Cry1Ac融合表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)上，從融合殺蟲蛋白對(duì)敏感、抗性小菜蛾BBMV的親和能力；融合殺蟲蛋白與敏感、抗性小菜蛾類鈣粘蛋白(Cadherin-likeprotein，CAD)的親和特性等方面研究PTD

3、對(duì)微生物殺蟲劑的增效和克抗機(jī)理。具體結(jié)果如下： 1.表達(dá)的六種融合殺蟲蛋白對(duì)小菜蛾3齡幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果表明：六種殺蟲蛋白浸漬葉片后對(duì)敏感和抗性小菜蛾均有殺蟲活性，加TAT肽的融合蛋白比未加TAT肽的融合蛋白的殺蟲活性均有一定程度的提高。如pET-21b+6His-tat-Cry1Ac(T)對(duì)美國敏感種群的LC50為1.19mg/L，而pET-21b+6His-Cry1Ac(P)對(duì)美國敏感種群的LC50為6.6mg/L，增效

4、倍數(shù)達(dá)到5.54倍；pET-21b-tat-Cry1Ac+6His(T')對(duì)美國抗性種群的LC50為12.94mg/L，而pET-21b-tat-Cry1Ac+6His(P')對(duì)美國抗性種群的Lc50為27.18mg/L，增效倍數(shù)為2.1倍，證明TAT肽對(duì)Bt殺蟲蛋白Cry1Ac具一定的增效作用，增效作用達(dá)顯著水平。 2.對(duì)克隆的小菜蛾抗性品系和敏感品系的鈣粘蛋白核苷酸進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：鈣粘蛋白核苷酸全長5314bp，編碼17

5、16個(gè)氨基酸。兩者氨基酸一致性達(dá)到99.42％，抗性品系相對(duì)于敏感品系，有10個(gè)氨基酸發(fā)生替換。 3.將CAD基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb，后轉(zhuǎn)座到感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，得到重組桿粒Bacmid/CAD后，轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，獲得重組的CAD蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為200kD，與理論值相符。Western-blot結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物與Cry1Ac結(jié)合后，可以與Cry1Ac的多克隆抗

6、體結(jié)合，進(jìn)一步說明目的蛋白CAD得到了表達(dá)，證明CAD是Cry1Ac的受體。 4.利用ELISA免疫檢測(cè)方法間接測(cè)定了融合殺蟲蛋白與小菜蛾中腸BBMV、融合殺蟲蛋白與鈣粘蛋白的親和性，結(jié)果表明TAT肽可顯著地增強(qiáng)Cry1Ac與BBMV、鈣粘蛋白的結(jié)合能力，如pET-21b+6His-tat-Cry1Ac(T)與美國敏感種群BBMV的OD450值為0.207，pET-21b+6His-Cry1Ac(P)的為0.165；T與敏感種群