PTD-Cry1Ac載體的構(gòu)建表達(dá)及殺蟲(chóng)活性研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑，在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用。編碼Bt殺蟲(chóng)蛋白的基因也作為最主要的殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入到了多種重要的糧棉作物中，在害蟲(chóng)防治中起著巨大的作用。但目前轉(zhuǎn)基因Bt農(nóng)作物和Bt制劑的使用正面臨著致命的威脅，即害蟲(chóng)對(duì)Bt的抗藥性。Bt毒素合理、有效的應(yīng)用引起了全世界的關(guān)注和討論。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD-ProteinTransductionDom

2、ain)是一類(lèi)能自動(dòng)穿透細(xì)胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)的一段富含精氨酸的多肽。近年來(lái)PTD在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用研究得到了空前的發(fā)展，其轉(zhuǎn)導(dǎo)特性已成功地應(yīng)用于多種疾病的臨床治療研究。 本研究通過(guò)PTD與Bt殺蟲(chóng)蛋白Cry1Ac融合表達(dá)載體的構(gòu)建、融合蛋白的表達(dá)純化、生物活性測(cè)定和免疫檢測(cè)，證明了PTD增強(qiáng)了Bt殺蟲(chóng)蛋白Cry1Ac的殺蟲(chóng)活性。主要結(jié)果如下： 1.按照6His-TAT-Cry1Ac-6His和

3、6His-Cry1Ac-6His的順序，合成6個(gè)組氨酸、11個(gè)氨基酸TATPTD，成功設(shè)計(jì)構(gòu)建了適合原核表達(dá)的四種PTD-Cry1Ac融合表達(dá)載體，即pET-1AC載體(含有pET-21b+Cry1Ac功能片段基因，簡(jiǎn)稱(chēng)P)、pET-T1AC載體(含有pET-21b+TAT肽+Cry1Ac功能片段基因，簡(jiǎn)稱(chēng)T)、pET-PQ1AC載體(含有pET-21b+部分Cry1Ac功能片段基因，簡(jiǎn)稱(chēng)PQ)、和pET-TQ1AC載體(含有pET-2

4、1b+TAT肽+部分Cry1Ac功能片段基因，簡(jiǎn)稱(chēng)TQ)。經(jīng)測(cè)序分析，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完全一致，表明獲得相應(yīng)融合表達(dá)載體。 2.對(duì)構(gòu)建的融合表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)。在20℃，116rpm，振蕩培養(yǎng)26h，IPTG濃度為0.1mol/ml條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，使表達(dá)的蛋白在上清大大多于沉淀，得到可溶性融合蛋白。這為純化提供了極大的便利條件。 3.融合表達(dá)蛋白以小菜蛾室內(nèi)種群和上海田間種群進(jìn)行生物測(cè)定。生測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：對(duì)小菜蛾室內(nèi)種群

5、，加TAT肽的融合蛋白pET-T1AC(T)的LC50為60.20μg/ml，而pET-1AC(P)蛋白LC50為80.82μg/ml，增效倍數(shù)為1.34倍；同樣，加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC(TO)的LC50為100.70μg/ml，而pET-PQ1AC(PQ)蛋白LC50為116.67μg/ml，增效倍數(shù)為1.16倍。對(duì)小菜蛾上海田間種群，加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC(TQ)的LC50為20.51μg/ml，而p

6、ET-PQ1AC(PQ)蛋白LC50為97.60μg/ml，增效倍數(shù)為4.76倍，表明PTD對(duì)Bt毒素Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白具有一定的增效作用。 4.四種融合蛋白進(jìn)行純化。純化的蛋白與兩個(gè)小菜蛾室內(nèi)種群的BBMV(BrushBorderMembraneVesicles)進(jìn)行ELISA免疫檢測(cè)，結(jié)果表明：在BBMV中加入T和TQ蛋白分別比加入P和PQ蛋白的吸光值要大，說(shuō)明T和TQ蛋白分別比P和PQ蛋白與小菜蛾BBMV結(jié)合性要強(qiáng)。同時(shí)