橡膠樹易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)、長期繼代培養(yǎng)及其植株再生研究.pdf

1、橡膠樹易碎胚性愈傷組織的成功誘導(dǎo)能為建立橡膠樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和橡膠樹原生質(zhì)體培養(yǎng)提供大量的良好材料。經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑可以將老態(tài)的品種重新幼態(tài)化,獲得幼態(tài)自根無性系,再生植株作為砧木使用,則可獲得均一的砧木無性系。橡膠樹組織培養(yǎng)高效植株再生體系的建立對(duì)建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系、生產(chǎn)大規(guī)模的自根幼態(tài)無性系和砧木無性系具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究橡膠樹組織培養(yǎng)體系,誘導(dǎo)了橡膠樹胚性愈傷組織,建立了胚性細(xì)胞懸浮體系及其再生體系,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了

2、易碎胚性愈傷組織的超低溫保存及其植株再生研究。此外,對(duì)易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚階段進(jìn)行石蠟切片,分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和變化特點(diǎn)。為今后橡膠樹細(xì)胞工程研究和遺傳轉(zhuǎn)化研究打下基礎(chǔ),為創(chuàng)造新的優(yōu)良種質(zhì)資源提供新的途徑和條件。主要結(jié)果如下:
　　 易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo):將單核靠邊期的橡膠樹熱研8-79品種花藥接種到花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(M1)[改良的MS培養(yǎng)基并添加2.0mg/L2,4-D、1.0mg/NAA、1.0mg/LKT、0.1g

3、/L肌醇、70g/L蔗糖、5％(v/v)CW、2.0g/L phytagel]上培養(yǎng)50d,取顏色鮮黃、狀態(tài)良好的初生愈傷組織接種到新鮮的M1上,10d繼代一次,多次繼代后可形成花藥易碎胚性愈傷組織。將橡膠樹熱研88-13品種幼果(開花后45-75天)內(nèi)珠被接種到內(nèi)珠被愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(M2)[改良的MS培養(yǎng)基并添加1.0mg/L2,4-D、1.0mg/LBAP、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5％(v/v)CW、2.0g/L phyt

4、agel]上培養(yǎng)50d,取顏色鮮黃、狀態(tài)良好的初生愈傷組織接種到新鮮的M2上,10d繼代一次,多次選擇繼代后可形成內(nèi)珠被易碎胚性愈傷組織。
　　 胚性細(xì)胞懸浮系的建立:取2g橡膠樹熱研8-79品種花藥易碎胚性愈傷組織接種到含20mL懸浮培養(yǎng)基(M3)[改良的MS培養(yǎng)基并添加1.0mg/L2,4-D、1.0mg/L NAA、0.5mg/L BAP、0.1g/L肌醇、50g/L蔗糖和5％(v/v)CW]的100mL,三角瓶中,5～7

5、d繼代一次,每次選新形成的細(xì)胞、小細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)液中,直到形成穩(wěn)定的懸浮系。
　　 胚性細(xì)胞懸浮系的優(yōu)化:通過對(duì)接種量、轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度、裝液量和激素的研究得出了橡膠樹熱研8-79品種花藥胚性細(xì)胞懸浮系的適宜生長條件為,接種量25g/L細(xì)胞FW,轉(zhuǎn)速100rpm,蔗糖濃度為50g/L,裝液量為40M1/150mL的三角瓶,優(yōu)化的懸浮培養(yǎng)基為(M4)[改良的MS培養(yǎng)基添加1.0m/L2,4-D、0.5mg/L NAA、1.5mg

6、/L KT、0.1g/L肌醇和5％(v/v)CW]。
　　 胚性細(xì)胞懸浮系誘導(dǎo)易碎胚性愈傷組織:將橡膠樹熱研8-79品種花藥懸浮細(xì)胞接種到易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(M5),[改良的MS培養(yǎng)基并添加1.5mg/L2,4-D、1.0mg/L NAA、0.5 mg/L BAP、0.1g/L肌醇、50g/L蔗糖和5％(v/v)CW、2.0g/L phytagel]上可誘導(dǎo)出易碎胚性愈傷組織,誘導(dǎo)率為100％。
　　 胚性細(xì)胞懸

7、浮系與易碎胚性愈傷組織的保持:采用固體-液體輪回保持法,不但可以對(duì)橡膠樹熱研8-79品種花藥易碎胚性細(xì)胞懸浮系和胚性愈傷組織系進(jìn)行長期繼代培養(yǎng),而且可以改善橡膠樹熱研8-79品種花藥易碎胚性細(xì)胞懸浮系和胚性愈傷組織的質(zhì)量。我們用這種方法對(duì)橡膠樹熱研8-79品種花藥胚性細(xì)胞懸浮系和易碎胚性愈傷組織長期繼代2年,其生長狀態(tài)良好,胚性也能保持良好。
　　 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和成熟:將橡膠樹熱研8-79品種花藥易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到優(yōu)化的體

8、細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(M6)[改良的MS培養(yǎng)基添加3.0mg/L KT、0.01mg/L NAA、0.97 mg/L BAP、0.1mg/L GA、0.1g/L肌醇、5％(v/v)CW和2.0g/L phytagel],可誘導(dǎo)較高頻率的體細(xì)胞胚發(fā)生,繼代1～2次,體細(xì)胞胚即可成熟。
　　 體細(xì)胞胚的萌發(fā)和植株再生:將橡膠樹熱研8-79品種花藥的成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到植株再生培養(yǎng)基(M7)[改良的MS培養(yǎng)基添加KT0.5mg/L、IAA0

9、.2mg/L、GA30.5mg/L、50g/L蔗糖、5％(v/v)CW、2.0g/L phytagel],可誘導(dǎo)較高頻率的植株再生,植株再生率達(dá)46.8％。
　　 易碎胚性愈傷組織的超低溫保存:適宜的保存程序?yàn)?把繼代培養(yǎng)15d、顏色鮮黃、生長狀態(tài)良好的橡膠樹熱研88-13品種內(nèi)珠被易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)基(M8)[改良的MS培養(yǎng)基并添加1.5mg/L2,4-D、1.0mg/L NAA、0.5mg/L BAP、0.1g/L

10、肌醇、5％(v/v)CW、90g/L蔗糖、5％(v/v)DMSO、2.0g/L phytagel]4℃預(yù)培養(yǎng)3d→60％PVS2室溫處理30min→PVS20℃冰浴溫度處理40min→迅速投入液氮→40℃解凍2～3min→含90g/L蔗糖的M5(不加phytagel)洗滌3次→TTC檢測(cè)和接種到M5上恢復(fù)生長。橡膠樹熱研88-13品種內(nèi)珠被易碎胚性愈傷組織恢復(fù)生長后胚性不喪失,仍可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生,目前正在誘導(dǎo)植株再生。