油茶FBPase基因和GAPDH基因的全長cDNA克隆及原核表達分析.pdf

1、油茶(Camellia oleifera)種子含油率較高,是我國南方重要的木本食用油料樹種。雖然目前已從油茶中分離出了一些基因,但還有大量基因未被分離鑒定出來,難以滿足油茶的品種改良的要求。FBPase和GAPDH是光合作用暗反應中非常重要的調控酶,克隆FBPase基因和GAPDH基因,解析FBPase基因和GAPDH基因的結構和功能,研究FBPase和GAPDH的基因調控機制,有利于揭示油茶光合作用的過程和機理,為提高油茶的光能利用率

2、和油茶產量提供科學依據(jù)。為此,我們開展了油茶FBPase和GAPDH的基因克隆、酶結構特點及活性、原核表達的研究,主要研究結果如下:
　　 1.油茶FBPase和GAPDH基因的全長克隆。在本實驗室已構建的油茶cDNA文庫和EST文庫的基礎上,利用專業(yè)軟件Primer Premier5.0設計引物,以油茶優(yōu)良無性系“湘林1號”的近成熟種子為材料,將提取的RNA反轉錄后的cDNA作為模板,采用5’RACE技術和3’RACE技術獲得

3、了FBPase基因和GAPDH基因的片段,將產物克隆至pMD18-T載體,轉化大腸桿菌DH5α菌株,進行測序驗證。通過網(wǎng)上BLAST比對測序結果,確認其為油茶的FBPase基因和GAPDH基因的全長cDNA序列,將該2個基因分別命名為CO-fbp和co-gapdh。其中,油茶FBPase基因的完整cDNA序列長度為1356 bp,ORF為1023 bp:油茶GAPDH基因的完整cDNA序列長度為1364 bp,ORF為1014 bp。<

4、br>　　 2.油茶FBPase和GAPDH的生物功能預測。應用一系列生物信息學軟件分析結合在線軟件分析,結果表明:油茶FBPase蛋白分子量為37.7K Da,理論等電點為5.54,其中負電荷氨基酸殘基數(shù)目為44,正電荷氨基酸殘基數(shù)目為38,屬于穩(wěn)定蛋白質,有三個比較明顯的跨膜區(qū),二級結構分析其有12個α螺旋,其編碼蛋白不含二硫鍵,證明此油茶FBPase基因不受光調控,推測其為胞質FBPase,其活性被AMP所抑制,最佳活性的pH為

5、8.0；油茶GAPDH基因編碼的蛋白質理論等電點為5.08,其分子式可寫成C3033H5054N1014O1282S216,油茶GAPDH蛋白質屬于不穩(wěn)定蛋白質,不穩(wěn)定系數(shù)為44.50,該蛋白在大腸桿菌中半衰期大于10個小時,脂肪系數(shù)為25.15,平均親水性0.692,該蛋白沒有跨膜區(qū)域,二級結構分析其有7個α螺旋。
　　 3.油茶FBPase和GAPDH基因的原核融合表達。分別設計了兩對特異表達引物,選用限制性內切酶Ndel和