西氏貝蛔蟲GAPDH基因和Tpx基因的原核表達(dá)與重組抗原診斷價值的評估.pdf

1、缸、，牛681lllllllllHL$111HIFllllllIJlllY3292796分熒芎翹玉5上⑧力10I裝掌大學(xué)SICHU^NAGRCUL九JR^LUNIVERSITY學(xué)號S2Ql盟512碩士學(xué)位論文西氏貝蛔蟲GAPDH基因和Tpx基因的原核表達(dá)與重組抗原診斷價值的評估李宇指導(dǎo)教師楊光友教授學(xué)科專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動物寄生蟲與寄生蟲病學(xué)2017年6月中文摘要大熊貓作為我國特有瀕危珍稀動物有活化石和國寶之稱，目前已被列入國家一級

2、重點保護(hù)動物。大熊貓西氏貝蛔蟲病是由西氏貝蛔蟲寄生于大熊貓小腸等器官所引起的一種寄生蟲疾病。西氏貝蛔蟲是圈養(yǎng)大熊貓體內(nèi)的一種常見寄生蟲，可引起宿主出現(xiàn)停食、嘔吐、腹瀉、消瘦、咳嗽、貧血、精神萎靡遲鈍等癥狀，蟲體還可造成大熊貓胃腸道、膽管及胰管堵塞等，嚴(yán)重時甚至引起死亡。目前對該病的診斷主要依靠飽和硫酸鎂漂浮法及PCR檢測法，但這兩種方法均不能對該疾病進(jìn)行早期診斷。本研究擴(kuò)增并原核表達(dá)了西氏貝蛔蟲硫氧還蛋白過氧化物酶和三磷酸甘油醛脫氫酶，

3、并對其蛋白在蟲體上的分布進(jìn)行了定位。同時，利用間接ELISA方法評價了硫氧還蛋白過氧化物酶和三磷酸甘油醛脫氫酶的診斷價值，為大熊貓西氏貝蛔蟲病的早期診斷和綜合防控奠定了基礎(chǔ)。一、西氏貝蛔蟲三磷酸甘油醛脫氫酶的特征分析與重組抗原診斷價值的評估3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH或G3PDH)是寄生蟲新陳代謝過程中的一個多功能酶，也是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶。有研究表明，GAPDH可作為寄生蟲病診斷的候選抗原。本研究從西氏貝蛔蟲的總RNA中擴(kuò)增出GA

4、PDH蛋白基因，其全長ORF框含有1083bp，共編碼360個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約40KDa，西氏貝蛔蟲GAPDH與豬蛔蟲GAPDH的序列相似性為98％，原核表達(dá)重組GAPDH蛋白的分子量約為57KDa。免疫印跡顯示：重組蛋白能被大熊貓西氏貝蛔蟲病陽性血清識別，且為單一條帶。熒光免疫組化顯示：BsGAPDH廣泛分布于整個蟲體，包括腸道、卵巢、肌肉、蟲卵、子宮和角皮，尤其是在腸道和蟲卵中的GAPDH蛋白含量豐富。以該重組蛋白為抗原建立大

5、熊貓西氏貝蛔蟲病間接ELISA診斷方法，結(jié)果顯示其敏感性為9583％，特異性為100％，提示該蛋白可以作為大熊貓蛔蟲病診斷候選抗原。二、西氏貝蛔蟲硫氧還蛋白過氧化物酶的特征分析與重組抗原診斷價值的評估寄生蟲作為一種需氧生物，面對的不僅是自身代謝所產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧分子(ROS)，還要抵抗來自于宿主免疫所產(chǎn)生的ROS，為了適應(yīng)這種雙重高氧化的脅迫壓力，寄生蟲需要通過一系列抗氧化系統(tǒng)來抵御ROS的氧化損傷作用，硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)