榮昌豬BPI基因全長cDNA克隆及SNP分析.pdf

1、殺菌通透性增強蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)是人和哺乳動物內(nèi)源性陽離子蛋白質(zhì)，主要存在于多形核白細胞的嗜苯胺藍顆粒中。它具有很強的殺菌(主要指革蘭氏陰性細菌)活性、中和內(nèi)毒素或脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)活性和調(diào)理功能，在動物機體天然防御中起到很重要的作用。目前，人、牛、鼠的BPI基因序列都已清楚，但豬BPI基因全長cDNA序列未知。此外，

2、人BPI基因外顯子3和4區(qū)域存在多態(tài)性，豬BPI基因第4和10外顯子的RFLP多態(tài)性與沙門氏菌的易感性有關，并被確定為抗病育種的候選基因。而被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為重點保護豬種的榮昌豬，其BPI基因外顯子3和4區(qū)域的多態(tài)性還有待研究。 本試驗擬克隆出榮昌豬BPI基因的全長cDNA序列，并應用聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorp

3、hism，PCR-SSCP)技術(shù)，檢測其第3和4外顯子的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點。這些結(jié)果的獲得，不僅可以為豬BPI功能研究、榮昌豬BPI基因多態(tài)性提供基礎數(shù)據(jù)，而且對進一步尋找到合適的抗病育種或相關分子標記、分析BPI基因多態(tài)性與榮昌豬抗病力的相關性和榮昌豬的保種選育等研究具有基礎貢獻意義。 試驗的方法及技術(shù)路線： (1)榮昌豬BPI基因全長cDNA克隆及生

4、物信息學分析： 首先選取一頭100日齡左右健康的榮昌豬，提取其前腔靜脈血總RNA，然后進行RT-PCR得到cDNA第一鏈；再根據(jù)同源性克隆方法，結(jié)合3'-和5'-cDNA末端快速擴增(RapidamlificationofcDNAends，RACE)技術(shù)，分別克隆出榮昌豬BPI序列的中間編碼區(qū)序列、3'-非編碼區(qū)序列(untranslatedregion，UTR)和5'-UTR；拼接出全長cDNA序列，并進行序列比對、結(jié)構(gòu)功能預

5、測等生物信息學分析鑒定。 (2)榮昌豬BPI基因第3和4外顯子序列SNP位點分析： 隨機選取120頭健康的榮昌豬，提取其耳組織基因組DNA，再以其為模板擴增出第3和4外顯子序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)，120V，4℃持續(xù)14h，然后銀染顯帶；統(tǒng)計不同帶型出現(xiàn)的頻率(即基因型頻率)和等位基因頻率，并將顯示不同帶型的PCR擴增產(chǎn)物克隆

6、測序；最后根據(jù)測序結(jié)果比對分析出外顯子3和4區(qū)段存在的SNP位點，并根據(jù)這些SNP位點在等位基因中的分布和等位基因頻率，計算出各SNP位點的優(yōu)勢堿基頻率。 試驗結(jié)果與結(jié)論： (1)本試驗首次克隆得到了榮昌豬BPI基因全長cDNA序列，也是豬BPI基因全長cDNA序列的首次報道，其Genebank登錄號為：EF436278。序列比對和結(jié)構(gòu)功能預測顯示，榮昌豬BPI同人、牛等物種BPI具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。 (2)本

7、試驗應用PCR-SSCP分析方法，在榮昌豬BPI基因外顯子3區(qū)段檢測到一個新的SNP位點，即第397位的G→A突變，引起氨基酸由Arg替換為Gln，且產(chǎn)生帶正電荷的Arg的堿基G為該位點的優(yōu)勢堿基，頻率為0.7417。該位點的突變可能對榮昌豬BPI蛋白功能及機體天然免疫力有重要影響。外顯子4區(qū)段共檢測到4個SNP位點，它們是T512C，G551T，C563T，G599A。其中T512C，G551T，C563T為首次報道，G551T突變還

8、產(chǎn)生了一個新的限制性內(nèi)切酶MscI或BalI酶切位點(TGG/CCA)。第512、551、563、599位的優(yōu)勢堿基分別為C、G、C、G，出現(xiàn)的頻率分別為0.6334，0.725，0.725，0.7501。此外，通過榮昌豬外顯子4序列與豬EST序列比對分析，還發(fā)現(xiàn)了一個第479位的T→C突變。榮昌豬BPI基因外顯子4區(qū)段的高度多態(tài)性，表明該區(qū)段有較大的遺傳選擇潛力。 通過分析推斷，本試驗檢測到的外顯子3和4區(qū)段的某些SNP位點，