凡納濱對(duì)蝦IRAK-4基因克隆及功能研究.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)，俗稱南美白對(duì)蝦，目前已成為全球占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的蝦類養(yǎng)殖品種。然而，在人工養(yǎng)殖過程中，對(duì)蝦容易受到病毒、細(xì)菌、真菌等各種病害的影響。而進(jìn)行對(duì)蝦免疫系統(tǒng)及其抗病害免疫機(jī)制的研究，對(duì)于預(yù)防和控制水產(chǎn)病害有重要意義。
　　 在無脊椎動(dòng)物中，Toll信號(hào)通路和Imd信號(hào)通路介導(dǎo)了主要的免疫反應(yīng)。白介素-1受體相關(guān)激酶-4(interleukin-1 receptor-associated

2、 kinase-4，IRAK-4)，在Toll信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用。本文首次從凡納濱對(duì)蝦cDNA中克隆到一個(gè)IRAK-4基因。凡納濱對(duì)蝦IRAK-4(LvIRAK-4)cDNA全長(zhǎng)1706bp，編碼536aa的蛋白。功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，IRAK4編碼蛋白在N端含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(68-129AA)，在C端含有一個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(259-532AA)，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性位點(diǎn)。LvIRAK-4的ORF外的5'上游調(diào)控

3、區(qū)片段(共3611bp)含有一個(gè)潛在的NFkB結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)STAT1結(jié)合位點(diǎn)。通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LvIRAK-4的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域與爪蟾IRAK-4(XtIRAK-4)的該區(qū)最為相似(48.2％)，其次為白眉猴(46.1％)和雜色鮑(46％)。而LvIRAK-4蛋白全長(zhǎng)與雜色鮑的HdIRAK-4最為相似(35.6％)，其次為爪蟾(35.5％)和斑馬魚(35％)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，LvIRAK-4廣泛存在于對(duì)蝦的組織中，并

4、在鰓、血細(xì)胞、盲囊和眼柄中表達(dá)量較其他組織高。本文還用RT-PCR在各種病原微生物感染6h后，分析了LvIRAK-4在凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞和鰓的表達(dá)時(shí)相，發(fā)現(xiàn)LvIRAK-4在轉(zhuǎn)錄水平上的變化不明顯。通過融合GFP來觀察LvIRAK-4的細(xì)胞定位狀況，發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)LvIRAK-4在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靠近質(zhì)膜區(qū)形成點(diǎn)狀聚集，但是當(dāng)單獨(dú)表達(dá)單個(gè)功能結(jié)構(gòu)域時(shí)，這種精確定位現(xiàn)象隨即消失。
　　 通過本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的抗菌肽報(bào)告基因載體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)