家蠶基因組中50-500nt非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)鑒定及表達(dá)譜研究.pdf

1、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一類(lèi)不編碼蛋白質(zhì)但有功能的RNA的總稱(chēng)，包括除開(kāi)放閱讀框外的其它所有RNA及mRNA前體中的內(nèi)含子序列及基因間區(qū)序列。幾乎所有生物體內(nèi)都存在非編碼RNA，它們通過(guò)RNA-DNA/染色質(zhì)、RNA/RNA和RNA/蛋白質(zhì)相互作用等方式參與到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色體復(fù)制、RNA加工與修飾、mRNA的穩(wěn)定性與翻譯、以及蛋白質(zhì)降解與轉(zhuǎn)運(yùn)等重要的生命過(guò)程中。新的ncRNA的發(fā)現(xiàn)和ncRNA功能的揭示

2、將極大豐富人們對(duì)生命世界的認(rèn)識(shí)，并對(duì)明確一些重大疾病的發(fā)病機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治療策略帶來(lái)革命性的突破，同時(shí)對(duì)生物進(jìn)化探索也具有重要意義。
　　 家蠶作為人類(lèi)最早馴化的動(dòng)物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)作為鱗翅目的模式生物，在研究昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育及農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)防治中也發(fā)揮著重要的作用。2004年，以西南農(nóng)業(yè)大學(xué)向仲懷院士乖夏慶友教授為首的科學(xué)家完成了對(duì)家蠶基因組全序列的測(cè)定，大大促進(jìn)了我國(guó)家蠶基因組學(xué)的研究。利用家蠶基因組序列提供的信息，充

3、分挖掘調(diào)控家蠶發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因，闡明調(diào)控家蠶發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)制，進(jìn)而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家蠶新品種，同時(shí)通過(guò)對(duì)發(fā)育過(guò)程基因表達(dá)調(diào)控的研究為鱗翅目害蟲(chóng)防治提供理論依據(jù)，已成為家蠶基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容。
　　 本研究在家蠶基因組測(cè)序完成的情況下構(gòu)建家蠶50-500nt ncRNA文庫(kù)，并對(duì)得到的新的ncRNA的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行研究，同時(shí)結(jié)合其宿主基因及上下游基因的表達(dá)模式預(yù)測(cè)ncRNA的功能，試圖從基因組水平上探討n(yōu)cRN

4、A可能參與的調(diào)控途徑及發(fā)揮作用的方式，為揭示家蠶發(fā)育分子機(jī)制提供理論依據(jù)。本文主要結(jié)果如下：
　　 1．通過(guò)實(shí)驗(yàn)RNA組學(xué)的方法，構(gòu)建了家蠶50-500nt ncRNA的cDNA文庫(kù)，共測(cè)序列3027個(gè)，得到新的ncRNA194個(gè)。通過(guò)保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征分析，得到45個(gè)C/D box snoRNA，83個(gè)H/ACA box snoRNA，不具有明顯結(jié)構(gòu)特征的ncRNA58個(gè)，另外還得到C/D-H/ACA box雜合子snoR

5、NA2個(gè)及新SRP RNA1個(gè)。
　　 2．除snRNA、tRNA、SRP外，家蠶新發(fā)現(xiàn)的ncRNA在一級(jí)序列上和其他物種同源性都很低。但8個(gè)C/D box snoRNA和36個(gè)H/ACA box snoRNA與其他物種snoRNA具有相同的功能元件。因此，共有141個(gè)新發(fā)現(xiàn)的ncRNA為家蠶所特有。
　　 3．通過(guò)基因組定位發(fā)現(xiàn)，家蠶新發(fā)現(xiàn)的ncRNA的產(chǎn)生方式多樣。103個(gè)位于編碼基因的內(nèi)舍子區(qū)，80個(gè)位于基因間區(qū)，

6、4個(gè)與編碼基因的第一個(gè)或最后一個(gè)外顯予重合，4個(gè)從編碼基因內(nèi)含子的互補(bǔ)鏈上轉(zhuǎn)錄出來(lái)，另外3個(gè)由預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)座子區(qū)轉(zhuǎn)錄而來(lái)。
　　 4．家蠶ncRNA很少以基因簇的形式存在，除2個(gè)位于基因間區(qū)的基因簇外，其他ncRNA均單獨(dú)存在或相距較遠(yuǎn)。內(nèi)含子起源的ncRNA都遵循一個(gè)內(nèi)含子編碼一個(gè)ncRNA的基因組織形式，這和果蠅不同。內(nèi)含子起源的snoRNA的宿主基因大部分都和核糖體加工及成熟相關(guān)，這和其他物種中的情況一致。
　　 5．

7、通過(guò)對(duì)ncRNA的靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，家蠶ncRNA的靶基因種類(lèi)多樣。22個(gè)C/D和49個(gè)H/ACA box snoRNA可以指導(dǎo)rRNA和snRNA的27個(gè)2'O-核糖甲基化和72個(gè)假尿嘧啶化位點(diǎn)修飾，其中3個(gè)C/D box snoRNA指導(dǎo)3個(gè)tRNA的4個(gè)甲基化位點(diǎn)修飾。另外，兩個(gè)C/D-H/ACA box雜合子snoRNA指導(dǎo)18S和5.8S rRNA的3個(gè)假尿嘧啶化位點(diǎn)修飾；3個(gè)C/D box snoRNA指導(dǎo)3個(gè)mRNA的修飾。

8、
　　 6．利用表達(dá)芯片及Northern雜交的方法，得到了123個(gè)新的ncRNA在家蠶卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)中的表達(dá)譜。其中36個(gè)在家蠶不同蟲(chóng)態(tài)的表達(dá)量存在顯著差異，且差異表達(dá)的ncRNA大部分在卵和成蟲(chóng)中表達(dá)量較高。在這36個(gè)差異表達(dá)的ncRNA中，不能歸類(lèi)的ncRNA占較大的比例。
　　 7．選取部分ncRNA對(duì)其在幼蟲(chóng)五個(gè)齡期和蛹期不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bm-86在五齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量顯著升高；Bm-51