膀胱癌中長鏈非編碼RNA表達譜及其作用機制研究.pdf

1、背景：長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA;轉錄本長度200nt-10Kb)最初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產(chǎn)物，并不具有任何生物學功能。但最近的研究表明，在多種腫瘤中都存在著lncRNA的異常表達，并且與腫瘤的生物學行為及預后密切相關。然而相對于目前篩查出的數(shù)萬條lncRNA而言，已經(jīng)鑒定出功能和作用機制的lncRNA僅占很小一部分。膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達情況及其可能的作用機制目前仍不清楚。

2、r>　　目的：闡明膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達情況及其可能的作用機制。
　　方法：⑴選取膀胱尿路上皮癌及配對的癌旁組織5對，通過Array star公司的lncRNA芯片進行膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達譜研究。⑵通過生物信息學分析篩選出差異表達的lncRNA和mRNA，并進行基因功能分析和信號通路分析，最后構建基因共表達網(wǎng)絡。⑶在差異表達最明顯的LncRNAs中隨機選擇4條(TNXA，CTA-134P22.2，CTC-276P9.1和

3、KRT19P3)，通過qRT-PCR在50對癌和癌旁組織中進行驗證。⑷從篩選出的差異表達表達的lncRNA中選出LOC572558進行后續(xù)的功能實驗。我們首先構建了過表達LOC572558的膀胱癌細胞穩(wěn)轉株，接下來通過CCK-8實驗檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，劃痕實驗和Transwell實驗檢測遷移和侵襲，來探討過表達LOC572558對膀胱癌細胞生物學行為的影響。⑷通過磷酸化蛋白芯片和western-blot檢測并驗證

4、過表達LOC572558后多條信號通路中蛋白磷酸化水平的變化，并通過生物信息學分析總結LOC572558是通過哪些信號通路中的關鍵蛋白發(fā)揮其調控作用的。
　　結果：①發(fā)現(xiàn)了3324條差異表達的LncRNA（在癌和癌旁組織差異表達2倍以上），其中明顯表達差異的LncRNA為110條（差異表達8倍以上），包括88條表達下調和22條表達上調的LncRNA。②通過生物信息學分析我們發(fā)現(xiàn)這些異常表達的LncRNA可能與膀胱癌的發(fā)生和進展有關

5、，其功能可能是通過調控P53、細胞周期或者PPAR信號通路中的蛋白而實現(xiàn)的。③過表達LOC572558可以抑制膀胱癌細胞的增殖，誘導發(fā)生晚期凋亡為主的凋亡，抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移，并使細胞周期阻滯于S期。④以15％為cutoff值，我們通過蛋白磷酸化芯片發(fā)現(xiàn)過表達LOC572558可以上調38個蛋白以及下調61個的蛋白磷酸化水平。生物信息學分析和Western-blot驗證表明p53和CREB是LOC572558發(fā)揮調控作用的關鍵基