瘢痕疙瘩中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜及基因組甲基化異常的初探.pdf

1、背景:
　　瘢痕疙瘩是人類特有的皮膚纖維增生性良性腫瘤。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)對編碼基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和DNA甲基化調(diào)控的表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控，廣泛參與各種生物學(xué)過程，在多種疾病尤其是腫瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用。研究表明，瘢痕疙瘩中存在lncRNA和DNA甲基化調(diào)控，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　目的:
　　初步探討lncRNA在瘢痕疙瘩中的表達(dá)以及其在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的潛在生物學(xué)

2、作用。初步分析DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控在瘢痕疙瘩發(fā)病中所起的作用。
　　方法:
　　1.對5例瘢痕疙瘩組織（實(shí)驗(yàn)組）及瘤旁正常組織（對照組），進(jìn)行l(wèi)ncRNA/mRNA芯片、lncRNA子類分析、信號(hào)通路分析及編碼-非編碼RNA共表達(dá)分析，篩選實(shí)驗(yàn)組和對照組中差異表達(dá)的lncRNA/mRNA，分析差異表達(dá)的lncRNA與mRNA之間相關(guān)作用關(guān)系。
　　2.從瘢痕疙瘩組織、包皮組織中分別分離并培養(yǎng)原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（

3、實(shí)驗(yàn)組）、正常成纖維細(xì)胞（對照組），3例實(shí)驗(yàn)組和3例對照組通過lncRNA/mRNA芯片、信號(hào)通路分析方法，篩選出組織和細(xì)胞中共同差異表達(dá)的lncRNA/mRNA，以及目的lncRNA，并在組織樣本中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。
　　3.對3例瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和3例正常成纖維細(xì)胞進(jìn)行甲基化DNA免疫沉淀-測序、啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化表達(dá)分析，找出組織和細(xì)胞中共同差異表達(dá)的mRNA與啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化的關(guān)系，篩選出目的mRNA并在組織

4、和細(xì)胞樣本中測定RNA相對表達(dá)水平，在擴(kuò)大的組織樣本中驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.瘢痕疙瘩組織與正常組織相比，有3680個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和5448個(gè)差異表達(dá)的mRNAs。其中上調(diào)和下調(diào)的lncRNA分別為2238個(gè)和1442個(gè);上調(diào)和下調(diào)的mRNA分別為2526個(gè)和2922個(gè)（差異倍數(shù)≥2且p值＜0.05）。
　　2.上調(diào)的mRNAs主要參與細(xì)胞外骨架形成和細(xì)胞外基質(zhì)合成，參與的信號(hào)通路最活躍的是細(xì)胞外基質(zhì)受

5、體相互作用通路，其余包括粘附、Wnt及PI3K/Akt通路等。下調(diào)的mRNAs主要參與物質(zhì)代謝過程和氧化還原過程，參與的信號(hào)通路最活躍的為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解通路，其余還有碳代謝通路等。
　　3.lncRNAs子類分析中，72.5％genic lncRNAs與其相關(guān)的mRNAs調(diào)節(jié)方向一致，27.5％genic lncNRAs與其相關(guān)的mRNAs調(diào)節(jié)方向相反。393個(gè)enhancer-like lncRNAs和864個(gè)l

6、incRNAs與其鄰近的差異性表達(dá)的基因有調(diào)節(jié)變化。
　　4.上調(diào)最活躍的通路中，5個(gè)mRNAs(COL5A2、COL6A2、ITGA1、ITGB1和THBS3)有相關(guān)的genic lncRNAs(ENST00000419029、uc010gqe.2、uc003jox.1、ENST00000414157和ENST00000447623)。下調(diào)最活躍信號(hào)通路中，僅ACAT2有相關(guān)的genic lncRNA:NR_037166。Wnt

7、信號(hào)通路中，有8個(gè)mRNAs存在相關(guān)的genic lncRNAs，1個(gè)mRNAs-PRKACB有enhancer-like lncRNA-ENST00000439186,3個(gè)mRNAs(CTBP1、FZD1和PRKACB)有l(wèi)incRNAs(TCONS_00007951、TCONS_00013884、TCONS_00014352和TCONS_00001546)。PI3K/Akt信號(hào)通路中，9個(gè)mRNAs有相關(guān)的genic lncRNAs

8、，2個(gè)mRNAs(COL5A1和THBS2)有enhancer-like lncRNAs(ENST00000423455、ENST00000439730和ENST00000413324)，5個(gè)mRNAs存在lincRNAs。
　　5.mRNAs-lncRNAs共表達(dá)分析中，ITGB1、COL5A2是與lncRNAs交聯(lián)最多的基因。一個(gè)lncRNA可與多個(gè)mRNAs相互作用，一個(gè)mRNA可與多個(gè)lncRNAs相互作用。
　　6

9、.與正常成纖維細(xì)胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中有1231個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和1744個(gè)差異表達(dá)的mRNAs。其中上調(diào)和下調(diào)的lncRNAs分別為738個(gè)和493個(gè)，上調(diào)和下調(diào)的mRNAs分別為1165個(gè)和579個(gè)(差異倍數(shù)≥2且p值＜0.05）。
　　7.瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中有71個(gè)共同差異表達(dá)的lncRNAs，271個(gè)共同差異表達(dá)的mRNAs。其中59個(gè)為上調(diào)的lncRNAs、12個(gè)為下調(diào)的lncRNAs，上

10、調(diào)和下調(diào)的mRNAs分別為183個(gè)和88個(gè)。
　　8.lncRNA(uc003jox.1、ENST00000414157和ENST00000439703)表達(dá)上調(diào)并且與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。在瘢痕疙瘩組織中l(wèi)ncRNA(uc003jox.1和ENST00000439703)表達(dá)較正常組織高。
　　9.瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中存在758個(gè)與mRNA相關(guān)的啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化，其中380個(gè)為與mRNA相關(guān)的啟動(dòng)子區(qū)差異高甲

11、基化，378個(gè)為與mRNA相關(guān)的啟動(dòng)子區(qū)差異低甲基化。
　　10.在組織和細(xì)胞中共同相對高表達(dá)，且啟動(dòng)子區(qū)低甲基化的mRNAs有S TEAP1、SLC38A5、CRISPLD2和IL32。在組織和細(xì)胞中共同相對低表達(dá)，且啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的mRNA為ALX1。
　　11.在細(xì)胞中，目的mRNAs(STEAP1、SLC38A5和IL32)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)高于對照。在組織中，目的mRNAs(STEAP1、SLC38A5和CRISPLD2