雞源大腸桿菌外排基因acrA的mRNA表達(dá)水平測定.pdf

1、本課題針對45株臨床分離和12株誘導(dǎo)的雞源大腸桿菌,根據(jù)CLSI2008推薦的方法進(jìn)行外排表型篩選實驗和ESBL初篩及確證實驗,利用PER擴(kuò)增方法對9株誘導(dǎo)產(chǎn)ESBLs腸桿菌進(jìn)行ESBLs基因型和基因亞型檢測,并用熒光定量RT—PCR(Real time quantitative RT—PCR)方法測定篩選出的4種菌株(①外排陽性、ESBLs陽性菌:G1、B4、C5、E3、078-A、078-B、078-C；②外排陰性、ESBLs陰性菌

2、:N2、ZM-5、ZM-6菌；⑧外排陰性、ESBLs陽性菌:F3；④外排陰性、ESBLs陽性菌:I1、N1、078)外排基因acrA的mRNA的絕對模板數(shù)量。通過MIC值測定觀察泵抑制劑對分離雞源大腸桿菌和誘導(dǎo)菌株抗菌藥物敏感性的影響,從表型上分析外排表型和ESBLs之間的關(guān)系,并通過對4種菌株的外排基因acrA的mRNA的絕對模板數(shù)量的測定在分子機(jī)制方面探索雞源大腸桿菌非特異性耐藥機(jī)制外排系統(tǒng)的過度表達(dá)和特異性耐藥機(jī)制ESBLs之間的

3、內(nèi)在聯(lián)系。
　　 檢測結(jié)果表明,從臨床分離的45株雞源大腸桿菌中,加入泵抑制劑利血平后,篩選出35株外排陽性菌,外排陽性率為78％,從中檢測出的ESBLs陽性菌篩選率為100％；加入CCCP后,篩選出42株外排陽性菌,外排陽性率為93％,從中檢測出的ESBLs陽性菌篩選率為93％；誘導(dǎo)菌株在第三代頭孢類藥物的作用下,12株誘導(dǎo)菌均為ESBLs陽性和外排表型陽性菌。誘導(dǎo)后的9株誘導(dǎo)菌分別用TEM、CTX—M、SHV、OXA型四對引

4、物進(jìn)行擴(kuò)增,其中861bpTEM型為9株,檢測率為100％；905bpCTX—M型為9株檢測率為100％；同時攜帶有TEM和CTX—M的菌株為9株,檢測率為100％。誘導(dǎo)菌株P(guān)CR產(chǎn)物克隆后測序表明,TEM型序列之間的同源性為98.4％～100％,其序列與GeneBank上公布EU979560(TEM-1)同源性為100％,核苷酸序列中有突變點,但沒有引起氨基酸位點的突變,所以仍屬于TEM-1型廣譜β-內(nèi)酰胺酶。雞大腸桿菌CTX—M型序

5、列的同源性為96％～100％,產(chǎn)CTX-M基因的基因亞型分別為CTX—M-14、CTX-M-24、CTX—M-65。
　　 熒光定量結(jié)果顯示,熒光定量結(jié)果顯示,臨床分離菌株的外排表型陽性菌中,ESBLs陽性組的acrA的mRNA的絕對模板數(shù)量為0.13×109～0.1 X1010,ESBLs陰性組acrA的的mRNA的絕對模板數(shù)量為0.22 X108,前者的的均值比后者顯著高出23倍,且統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P<0.01)；在外排陰

6、性菌株中,ESBLs陽性組acrA的mRNA的絕對模板數(shù)量為0.11×108～0.16×109,ESBLs陰性組acrA的mRNA的絕對模板數(shù)量為O.32 X108～O.43 X108,前者mRNA的表達(dá)量是后者的3倍,統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P>O.05)。在ESBLs陽性菌株中,外排表型陽性組acrA的mRNA的表達(dá)量為0.13×109～O.1×1010,外排表型陰性組acrA的mRNA的表達(dá)量為O.11×108～O.16X109,前者是

7、后者的7倍,統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)；在ESBLs陰性菌株中,外排表型陽性組acrA的mRNA的表達(dá)量為0.22×108,外排表型陰性組的mRNA的表達(dá)量為0.32×108～0.43×108,前者是后者的0.4倍,統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P>0.05)。誘導(dǎo)菌株中,誘導(dǎo)前外排表型和ESBLs為陰性的大腸桿菌acrA基因的mRNA的表達(dá)量為0.25X108,誘導(dǎo)后外排表型和ESBLs為陽性組acrA的mRNA的表達(dá)量為0.2X109～0.