大腸桿菌xylA和xylB基因的克隆與表達(dá).pdf

1、隨著人們對(duì)全球性能源危機(jī)認(rèn)識(shí)的不斷加深及環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，開(kāi)發(fā)新的替代能源已是刻不容緩的重大戰(zhàn)略問(wèn)題。生物乙醇作為一種可再生的替代能源，日益受到各國(guó)的重視。如何利用廉價(jià)生物質(zhì)等可再生資源進(jìn)行生物乙醇生產(chǎn)已成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)之一。 本中心在這樣的背景下進(jìn)行Zymomonasmobilis基因工程改造，使其能發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇。本文研究?jī)?nèi)容為中心大課題的一部分，即克隆并表達(dá)大腸桿菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)與木酮糖激酶基因(xy

2、lB)。 首先通過(guò)紫外誘變、Ap富集與X-EMB平板篩選得到木糖營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株787。通過(guò)PCR反應(yīng)克隆大腸桿菌K12xylAB，PCR產(chǎn)物以pBSKS(+)為載體引入菌株787，經(jīng)篩選平板篩選和轉(zhuǎn)化子酶活測(cè)定判斷克隆得到的DNA片段即為目的片段xylAB。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明克隆得到的DNA片段為目的片段xylAB。然后將xylAB與穿梭質(zhì)粒pZB1相連構(gòu)建成pZB1-xylAB質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DH5α與Z.mobilisCP4。最

3、后，利用PCR重疊延伸技術(shù)將大腸桿菌xylAB自身的啟動(dòng)子換成Z.mobilisCP4的gap基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建成pZB1-Pgap-xyIAB，并分別轉(zhuǎn)化DH5α與Z.mobilisCP4。 通過(guò)半胱氨酸-咔唑的方法測(cè)定菌株粗酶液的XI酶活，D-木酮糖-NADH耦聯(lián)法測(cè)定XK酶活，結(jié)果表明：大腸桿菌DH5α(pZB1-xylAB)XI酶活為DH5α(pZB1)的2倍，而XK酶活為DH5α(pZB1)的100倍，DH5α(pZB