蚓激酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá).pdf

1、本論文重點(diǎn)研究了蚓激酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，并對工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。主要研究結(jié)果如下：
　　 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得蚓激酶成熟肽基因F238，并將其克隆至大腸桿菌質(zhì)粒pET-22b（+）中，構(gòu)建表達(dá)載體pET-F238。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），1.0mmol/LIPTG、37℃條件下誘導(dǎo)5h，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)蚓激酶成熟肽蛋白獲得了表達(dá)，所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在，但

2、主要以包涵體的形式存在，相對分子量與預(yù)期的26kDa相符。
　　 為了實(shí)現(xiàn)蚓激酶基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，將PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得蚓激酶基因F238克隆至大腸桿菌質(zhì)粒pET22b-TrxA中，構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體PTrx-F238。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），1.0 mmol/L IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)5h，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)蚓激酶成熟肽蛋白獲得了高效表達(dá)，所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物相對分子量與預(yù)期的26kDa相符，且

3、都是可溶性蛋白，表明分子伴侶TrxA起到了幫助目的蛋白正確折疊的作用。
　　 以PTrx-F238/BL21為工程菌，用纖維蛋白平板法對蚓激酶的纖溶活性進(jìn)行檢測，初始酶活為141.6U/mL。本研究先利用單因素分析考察了碳源、氮源、玉米漿、無機(jī)鹽等對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，然后用正交設(shè)計確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳產(chǎn)酶組成為：1％蔗糖，1％硫酸銨，0.8％玉米漿，0.01mmol/L氯化鈣；并利用單因素確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始pH7.0