豬SKIP和SHIP2基因的克隆、遺傳效應(yīng)及功能初步研究.pdf

1、豬肌肉組織中能量的貯存、釋放、轉(zhuǎn)移和利用是決定肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和豬肉品質(zhì)的重要因素。水解磷脂酰肌醇(phosphatidyldinositol,PI)的肌醇多磷酸5-磷酸酶家族成員對(duì)細(xì)胞的糖脂代謝信號(hào)和膜運(yùn)輸起重要調(diào)節(jié)作用。其中骨骼肌和腎臟高表達(dá)的5’肌醇磷酸酶(Skeletal muscle and kidney enriched inositol phosphatase,SKIP)和包含SH2結(jié)構(gòu)的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SH2-cont

2、aining inositol polyphosphate5-phosphatase,SHIP2)都能通過(guò)水解胰島素介導(dǎo)的脂質(zhì)第二信使PI(3,4,5)P3,負(fù)調(diào)控PI3K依賴的胰島素信號(hào)通路,是影響動(dòng)物個(gè)體生長(zhǎng)速度和肉用品質(zhì)的候選基因。因此,本研究對(duì)豬SKIP和SHIP2基因進(jìn)行了分離和遺傳效應(yīng)分析,研究了它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)理,并運(yùn)用RNAi方法對(duì)SKIP的功能進(jìn)行了驗(yàn)證,取得了以下結(jié)果:
　　 1采用電子克隆方法獲得兩個(gè)候選基

3、因的cDNA序列,均包括完整的編碼區(qū)(CDS)序列:(1)SKIP,獲得eDNA序列1575 bp,其中CDS1353 bp,GenBank登錄號(hào)GQ504265。(2)SHIP2,獲得cDNA序列4411bp,其中CDS3795 bp,GenBank登錄號(hào)為GU391030。根據(jù)基因組比較圖譜將SKIP基因定位于豬12號(hào)染色體SSC12q1.3,將SHIP2基因定位于豬9號(hào)染色體SSC9p23-24。分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),發(fā)現(xiàn)豬SKIP與牛

4、進(jìn)化關(guān)系較近,豬SHIP2與狗進(jìn)化關(guān)系較近。
　　 2采用RCR-RFLP技術(shù),在不同豬種中對(duì)2個(gè)候選基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,并在大白×梅山F2代群體中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明(1)SKIP,第12外顯子G136A位點(diǎn)與皮率,至第一頸椎胴體長(zhǎng),至第一肋胸胴體長(zhǎng)呈極顯著相關(guān)(P<0.01),與肌內(nèi)脂肪,含水率呈顯著相關(guān)(P<0.05),第6內(nèi)含子A17G位點(diǎn)與骨率,內(nèi)脂率,至第一肋胸胴體長(zhǎng)呈極顯著相關(guān)(P<0.01),與至

5、第一頸椎胴體長(zhǎng)呈顯著相關(guān)(P<0.05):第1內(nèi)含子C1092T位點(diǎn)與內(nèi)脂率,至第一肋胸胴體長(zhǎng),股二頭肌大理石紋,肌內(nèi)脂肪含量呈顯著相關(guān)(P<0.05),與背最長(zhǎng)肌大理石紋呈極顯著相關(guān)(P<0.01)；(2)SHIP2,第21內(nèi)含子G410A與皮率顯著相關(guān)(P<0.05),與肩部最厚處背膘厚,眼肌高,眼肌寬呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。
　　 3運(yùn)用RNA干擾技術(shù)和超表達(dá)技術(shù)研究了SKIP在分化肌細(xì)胞C2C12中的功能,West

6、ern biot分析發(fā)現(xiàn)抑制SKIP的表達(dá)使胰島素介導(dǎo)的Akt(蛋白激酶B)的磷酸化水平、GSK-3β(糖原合酶激酶)的磷酸化水平,和GS(糖原合酶)的去磷酸化水平都有顯著提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在肌細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)外源豬SKIP時(shí),胰島素介導(dǎo)的糖原合成量顯著減少。表明在肌細(xì)胞中,SKIP對(duì)Akt/GSK-3β/GS介導(dǎo)的糖原合成信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)也解釋了SKIP基因多態(tài)影響肉質(zhì)性狀的分子機(jī)理。
　　 4利用基因組PCR步移方法獲得

7、豬SKIP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2075bp的啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)潛在的MyoD結(jié)合位點(diǎn),若干Sp1結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)位于起始密碼子上游的CpG島。以啟動(dòng)子序列為模板,用PCR方法獲得5個(gè)5’側(cè)翼缺失片斷構(gòu)建pGL3-basic的雙熒光素酶報(bào)告基因載體,并將這些載體分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌分化前體細(xì)胞和肌管細(xì)胞,熒光素酶活性分析推測(cè)在啟動(dòng)子的-1845到-1171和-1171到-737兩處地方存在轉(zhuǎn)錄抑制元件,在-2038到-18

8、45處存在潛在的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。
　　 5半定量分析發(fā)現(xiàn),SKIP在成年大白豬肌肉組織中高表達(dá),并且在骨骼肌細(xì)胞的分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。利用定點(diǎn)突變和RNA干擾技術(shù),分析了SKIP啟動(dòng)子中潛在E-box元件和轉(zhuǎn)錄因子MyoD對(duì)SKIP轉(zhuǎn)錄的影響。發(fā)現(xiàn)突變E-box元件和抑制MyoD的表達(dá)都顯著降低了肌管細(xì)胞中。SKIP啟動(dòng)子的活性,表明MyoD可能通過(guò)順式作用元件E-box介導(dǎo)SKIP在肌管細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá),并且TGF-β也以MyoD

9、依賴的方式調(diào)控SKIP的轉(zhuǎn)錄。
　　 6利用RNA干擾技術(shù)分析了轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)SKIP的轉(zhuǎn)錄影響。定量分析發(fā)現(xiàn)Sp1基因的表達(dá)抑制使SKIP啟動(dòng)子活性顯著下降,表明轉(zhuǎn)錄因子Sp1可能通過(guò)順式作用元件GC-box對(duì)肌肉細(xì)胞分化過(guò)程中SKIP基因的轉(zhuǎn)錄激活起正向調(diào)控作用。同時(shí),SKIP啟動(dòng)子活性在Sp1和MyoD雙重表達(dá)抑制的肌細(xì)胞中與在Sp1或MyoD單一表達(dá)抑制的肌細(xì)胞中相比,差異不顯著,表明Sp1可能與MyoD家族成員協(xié)同激

10、活肌細(xì)胞分化過(guò)程中SKIP的表達(dá)。
　　 7利用豬基因組信息,分離獲得豬SHIP2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1820 bp的啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Sp1,E2F,MyoD,E47,E2等轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)和覆蓋整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。以啟動(dòng)子序列為模板,用PCR方法獲得5個(gè)5’側(cè)翼缺失片斷構(gòu)建pGL3-basic雙熒光素酶報(bào)告基因載體,并將這些載體分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌分化前體細(xì)胞和肌管細(xì)胞,熒光素酶活性分析推測(cè)在啟動(dòng)子的

11、-1849到-1742存在轉(zhuǎn)錄抑制元件,在-1742到-1694處存在轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件,從-1742到-1266處476bp序列已足夠使SHIP2正常轉(zhuǎn)錄。
　　 8半定量分析發(fā)現(xiàn)SHIP2在成年大白豬的肌肉組織中高表達(dá),定量分析發(fā)現(xiàn)SHIP2在骨骼肌細(xì)胞的分化早期表達(dá)上調(diào)而在分化中晚期表達(dá)下調(diào)。利用RNA干擾技術(shù),分析了轉(zhuǎn)錄因子MyoD和Sp1對(duì)SHIP2轉(zhuǎn)錄的影響。MyoD或Sp1的表達(dá)抑制均顯著降低了SHIP2的啟動(dòng)子活性,表