鴨病毒性腫頭出血癥病毒強(qiáng)毒生物學(xué)特性.pdf

1、鴨病毒性腫頭出血癥(Duckviralswollenheadhemorrhagicdisease，DVSHD)是由鴨病毒性腫頭出血癥病毒(Duckviralswollenheadhemorrhagicdiseasevirus，DSHDV)引起鴨的急性傳染病。臨床癥狀表現(xiàn)為病鴨頭頸腫脹、眼結(jié)膜充血出血、肝臟腫大呈土黃色并伴有出血斑點(diǎn)、體溫升至43℃以上、排草綠色稀糞等。該病發(fā)病率高死亡率高，各種年齡階段、各品種的鴨均可感染，涉及品種有天府

2、肉鴨、櫻桃谷鴨、北京鴨等，最早3日齡開(kāi)始發(fā)病，最遲500日齡仍然有發(fā)病，該病是近年來(lái)嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種新的傳染病。經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖解、病原的分離鑒定、超薄切片觀察、理化特性測(cè)定、交叉中和試驗(yàn)等一系列研究，初步認(rèn)為該病是由呼腸孤病毒引起的一種新型傳染病，目前只有少量資料報(bào)道。
　　 本研究對(duì)DSHDV強(qiáng)毒生物學(xué)特性及其免疫原性展開(kāi)研究，獲得以下系列結(jié)果：
　　 1.鴨病毒性腫頭出血癥病毒強(qiáng)毒對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)

3、及其增殖規(guī)律：將DSHDV人工感染青年鴨成功復(fù)制出典型的臨床病例，癥狀與之前報(bào)道一致。病毒可適應(yīng)在10日齡鴨胚中增殖；將DSHDV鴨胚尿囊液感染DEF細(xì)胞，盲傳2次即可適應(yīng)DEF細(xì)胞，連續(xù)傳代5次后細(xì)胞病變時(shí)間穩(wěn)定，CPE一般出現(xiàn)于感染后72h；DSHDV在DEF上的病毒滴度(TCID50)隨傳代次數(shù)增加而逐漸增加，到第5代時(shí)趨于穩(wěn)定的水平，達(dá)到106.55-106.91/ml。病毒在接種細(xì)胞后，毒價(jià)呈現(xiàn)出先下降再逐漸上升的特點(diǎn)，0h-

4、8h毒價(jià)直線(xiàn)下降，8h-72h快速上升，72h-120h毒價(jià)較高，是收獲該DSHDV細(xì)胞毒的最適時(shí)間。
　　 2.鴨病毒性腫頭出血癥病毒強(qiáng)毒的形態(tài)發(fā)生學(xué)和鴨胚成纖維細(xì)胞的病理變化：電鏡下可見(jiàn)DSHDV病毒粒子呈圓形或橢圓形，無(wú)囊膜，具有雙層核衣殼，成熟病毒外衣殼直徑75nm-85nm，平均80nm左右；病毒空衣殼直徑為60nm-75nm；病毒粒子復(fù)制早期多散在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，隨著子代病毒的增多，聚集在胞漿包涵體結(jié)構(gòu)中。DSHDV病

5、毒粒子通過(guò)吸附于DEF細(xì)胞膜表面而進(jìn)入細(xì)胞，在胞漿中完成脫殼、復(fù)制和裝配過(guò)程，子代病毒粒子通過(guò)細(xì)胞膜破裂的方式釋放到胞外。在感染后12h首次于細(xì)胞漿中觀察到子代病毒粒子；在感染后24h首次觀察到包涵體結(jié)構(gòu)。被DSHDV感染的DEF細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病變主要表現(xiàn)為：細(xì)胞核變形，染色質(zhì)異常聚集，線(xiàn)粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，胞漿出現(xiàn)大量空泡，部分細(xì)胞發(fā)生融合和凋亡變化，感染后期細(xì)胞中還出現(xiàn)大量的不規(guī)則形狀的包涵體。
　　 3.鴨病毒性腫頭

6、出血癥病毒強(qiáng)毒致體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡：(1)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下均可觀察到DSHDV誘導(dǎo)DEF細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化：如細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核變形嚴(yán)重，染色質(zhì)高度凝集、邊緣化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體空泡化，晚期出現(xiàn)大量大小不一、形態(tài)各異的凋亡小體；(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，受感染細(xì)胞的DNA降解形成的典型梯狀條帶；(3)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，凋亡細(xì)胞的比率從感染后24h快速上升，96h的

7、達(dá)到凋亡的最高峰，而后逐漸下降，同時(shí)伴隨著壞死細(xì)胞的比例逐漸升高；(4)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記的感染DEF細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡可觀察到發(fā)出陽(yáng)性熒光信號(hào)的凋亡細(xì)胞。
　　 4.鴨病毒性腫頭出血癥病毒的提純及其形態(tài)觀察：通過(guò)對(duì)多種DSHDV純化方法的比較研究，最后采取了反復(fù)凍融、差速離心、PEG6000沉淀、30％蔗糖墊底超速離心以及CsCl不連續(xù)密度梯度離心相結(jié)合的方法對(duì)DSHDV進(jìn)行純化，結(jié)果證實(shí)該方法快速高效，純化

8、的病毒純凈。負(fù)染可見(jiàn)成熟的DSHDV病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，直徑在80nm-85nm之間，表面顆粒狀突起，內(nèi)部有電子密度較深的區(qū)域。
　　 5.鴨病毒性腫頭出血癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白分析：將純化獲得的DSHDV病毒制備成抗原多點(diǎn)多次免疫家兔，成功制備了兔抗DSHDV的高免血清，并通過(guò)辛酸-硫酸銨粗提及HighQ陰離子交換柱純化兔抗DSHDV的血清IgG。蛋白質(zhì)變性凝膠電泳結(jié)果顯示：DSHDV病毒顆粒由10條主要結(jié)構(gòu)蛋白(Virusstr