鴨病毒性腫頭出血癥病毒感染特性及其免疫檢測技術(shù)的研究.pdf

1、1998-2003年四川省、重慶市、貴州省和云南省等養(yǎng)鴨省份發(fā)生了一種以鴨頭腫脹、眼結(jié)膜充血、出血，全身皮膚廣泛性出血，肝腫脹呈土黃色，并伴有出血斑點，體溫43℃以上，排草綠色稀糞等特征性的急性病毒性傳染病。該病目前給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。程安春等通過流行病學調(diào)查、臨床癥狀和病理學變化觀察、病理組織學檢查、病原的分離鑒定、人工感染試驗、電鏡觀察、防治試驗，確診為一種新的鴨病，并命名為“鴨病毒性腫頭出血癥(Duckviralswol

2、lenheadhemorrhagicdisease，DVSHD)”。國內(nèi)其他學者也稱之為“鴨傳染性腫頭癥”或“鴨腫頭敗血癥”。
　　 本病與鴨瘟在臨床特征和尸檢變化上有許多相似之處，鴨病毒性腫頭出血癥病毒(Duckswollenheadhemorrhagicdiseasevirus，DSHDV)是該病的病原。目前有關(guān)該病的研究資料報道較少，特別是有關(guān)DSHDV感染特性以及特異、敏感、快速的檢測方法等更是缺乏深入研究。因此，本文對

3、鴨病毒性腫頭出血癥病毒的對成年鴨和鴨胚感染特性以及相關(guān)的免疫檢測技術(shù)進行了一系列的研究。
　　 本研究獲得以下系列結(jié)果：
　　 1.鴨病毒性腫頭出血癥實驗感染模型的建立：本實驗用鴨病毒性腫頭出血癥病毒強毒（HY-99株）作為種毒，通過肌注、口服和滴鼻三種方式感染28日齡健康鴨，攻毒后每天觀察臨床癥狀和發(fā)病鴨及死亡鴨的剖檢變化。結(jié)果顯示，感染鴨出現(xiàn)以體溫升高、頭頸腫脹、眼結(jié)膜充血、出血、排灰白色或草綠色稀糞為主要特征的臨床

4、癥狀和肝臟腫大、出血呈土黃色、免疫器官和消化道嚴重充血、出血為主要特征剖檢變化。結(jié)果表明，臨床癥狀和剖檢變化與自然感染鴨基本一致，本實驗成功構(gòu)建了鴨病毒性腫頭出血癥實驗感染模型。感染鴨各個組織器官進行了動態(tài)組織病理學變化觀察。結(jié)果表明，實驗感染模型中三組鴨出現(xiàn)的組織病理學變化基本一致，但時間存在差異：肌注組鴨于感染后72h內(nèi)、滴鼻組和口服組144h內(nèi)組織病理學變化以充血、出血和炎性細胞浸潤為主；肌注組鴨于感染72h后、滴鼻組和口服組14

5、4h后組織病理學變化以彌漫性出血、大小不等壞死灶或粘膜上皮細胞的壞死為主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心臟和腎臟等是主要的靶器官。這表明DSHDV是一種泛嗜性病毒，對全身各個組織器官具有嚴重破壞作用。
　　 3.DSHDV強毒在人工感染鴨宿主細胞內(nèi)的形態(tài)發(fā)生學和超微病理學研究：電鏡下，完整DSHDV粒子呈圓形或橢圓形，無囊膜，直徑為70nm-85nm。病毒粒子僅出現(xiàn)在感染細胞的胞漿中。電鏡下，可觀察到病毒粒子于感染4h后

6、吸附于法氏囊靶細胞表面，并通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞后，在胞漿內(nèi)脫去雙層衣殼，隨后在胞漿內(nèi)復(fù)制并合成病毒相關(guān)蛋白。這些合成結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞漿內(nèi)聚集成圓形、橢圓形或不規(guī)則形的包涵體結(jié)構(gòu)。感染后24h-72h，病毒核酸在這些基質(zhì)上組裝和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后，成熟病毒通過細胞的崩解而釋放到細胞間隙。DSHDV強毒人工感染成年鴨后能夠引起宿主細胞明顯的超微結(jié)構(gòu)變化（壞死和凋亡）。該病毒的主要靶器

7、官包括法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟、消化道和腎臟等器官。病毒侵染靶細胞主要有：淋巴細胞、肝細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、上皮性網(wǎng)狀細胞、粘膜上皮細胞、腸腺細胞等。
　　 4.DSHDV強毒致人工感染鴨和鴨胚宿主細胞凋亡的研究：通過TEM法觀察發(fā)現(xiàn)，DSHDV經(jīng)尿囊腔感染10日齡鴨胚后尿囊膜上皮細胞、肝細胞、腸道上皮細胞和心肌細胞發(fā)生凋亡。凋亡細胞時間分布在感染后24h-96h，同時在部分宿主細胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量病毒粒子。本研究利用HE

8、染色法、TEM法和TUNEL法三種方法均觀察到DSHDV感染誘導(dǎo)鴨宿主細胞的凋亡。發(fā)生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、心臟、食管、腺胃和腸道。宿主細胞的凋亡指數(shù)從感染后2h到72h逐漸增加，72h達到最高值。感染72h后，瀕死鴨和死亡鴨宿主細胞死亡以典型壞死為主。DSHDV感染誘導(dǎo)的細胞凋亡在DVSHD的致病機制中起到重要作用。
　　 5.免疫酶組織化學檢測DSHDV抗原方法的建立和應(yīng)用：本研究以兔抗DSHDVIg

9、G作為一抗、HRP-羊抗兔IgG作為二抗建立并優(yōu)化了在石蠟切片中檢測DSHDV抗原的間接免疫酶SP法，研究證實本方法具有較高的特異性和敏感性。該方法的應(yīng)用研究揭示，三組鴨感染DSHDV后，肌注組(4h)、滴鼻組(12h)和口服組(24h)依次首先從法氏囊組織中檢測陽性信號，隨后抗原在多個組織中檢出，包括免疫器官、消化腺、消化道、腎臟、心臟、肺臟和氣管等。DSHDV侵染的靶細胞主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、網(wǎng)狀細胞、粘膜上皮細胞、肝細胞、間

10、質(zhì)細胞、腺泡細胞、腸腺細胞、腎小管上皮細胞、心肌細胞和柱狀上皮細胞等。
　　 6.間接ELISA檢測鴨病毒性腫頭出血癥抗體方法的建立和應(yīng)用：本研究以濃縮純化的DSHDV作為包被抗原，建立了檢測DSHDV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。試驗最佳反應(yīng)條件為：抗原最佳稀釋度為1：40，高免血清為1：80稀釋，最佳反應(yīng)時間為60min；酶標抗體為1：2000稀釋，最佳反應(yīng)時間為60min；封閉液為1％BSA-PBST，封閉時間