我國(guó)雞馬立克氏病毒流行毒株生物學(xué)特性分析.pdf

1、雞馬立克氏病(MD)是由雞馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種高度接觸性傳染性疾病。發(fā)病雞表現(xiàn)為精神萎靡、麻痹、共濟(jì)失調(diào)、翅膀下垂、呆立，被毛凌亂等臨床癥狀，剖檢可見內(nèi)臟和其他器官發(fā)生淋巴增生性腫瘤。同時(shí)，該病可引起發(fā)病雞只的免疫抑制，造成其他病原的繼發(fā)感染。MD呈世界范圍內(nèi)的流行，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失在10～20億美元。疫苗免疫是控制該病的主要手段。MD疫苗免疫屬于非清除性免疫，不能夠阻止野毒株的感染及排毒，導(dǎo)致野毒株與疫苗毒株長(zhǎng)期共

2、存于同一機(jī)體，促使野毒株毒力進(jìn)化。過去的幾十年里，MDV持續(xù)性演化，同期使用的MD疫苗保護(hù)效果不理想。近些年我國(guó)小型養(yǎng)禽場(chǎng)甚至規(guī)?；B(yǎng)禽場(chǎng)也常有MD發(fā)生，并且常伴隨其它臨床表現(xiàn)不明顯的免疫抑制病病原REV，ALV和CIAV等的混合感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此有必要了解我國(guó)近年來雞群中MDV感染和流行，以及其與免疫抑制病毒混合感染的情況;分析我國(guó)的MDV野毒株的致病特征和毒力變異規(guī)律;評(píng)價(jià)現(xiàn)有MD疫苗的免疫保護(hù)效果;分析MDV野毒

3、株的主要致病相關(guān)基因和病毒基因組的分子特征，研究其進(jìn)化規(guī)律。這些對(duì)MDV的基礎(chǔ)研究和我國(guó)MD的防控均具有極其重要的意義。
　　本研究于2011年～2013年間，在黑龍江、吉林、遼寧、山東、河北、江蘇、內(nèi)蒙古、湖南、河南和廣東等10個(gè)省份的136個(gè)蛋雞或種雞群，從臨床表現(xiàn)和病理變化疑似發(fā)生MD的雞無菌采集羽髓或抗凝血，共計(jì)522份。經(jīng)PCR檢測(cè)，522份樣品中MDV陽性樣品334份，陽性率為64％;檢測(cè)的136個(gè)雞場(chǎng)中95個(gè)雞群中M

4、DV感染陽性率為69.9％;應(yīng)用PCR，間接免疫熒光和/或ELISA等檢測(cè)方法，對(duì)所有MDV陽性樣品進(jìn)行了其他免疫抑制病病毒-REV、ALV和CIAV的檢測(cè)，結(jié)果表明MD陽性雞群中REV、ALV和CIAV的陽性率分別為11.7％、21.0％和21.3％，存在著較為嚴(yán)重的混合感染，甚至三重和四重感染;從MDV陽性樣品中分離獲得45株適應(yīng)細(xì)胞的病毒株，其中43株經(jīng)PCR，間接免疫熒光和/或ELISA等檢測(cè)證實(shí)為REV、ALV和CIAV陰性，

5、經(jīng)MDV的132堿基重復(fù)序列(132bpr)的PCR檢測(cè)分析，證實(shí)獲得的43株分離毒株含有2個(gè)或3個(gè)拷貝的132bp均具有MDV野毒株的特征，而另外2株經(jīng)PCR、蝕斑、間接免疫熒光和電鏡等方法鑒定，證實(shí)為MDV和REV混感的細(xì)胞培養(yǎng)物。
　　對(duì)43株新分離的MDV野毒株及其他的MDV參考毒株的主要致腫瘤基因-meq基因序列比對(duì)和分析，結(jié)果顯示中國(guó)流行毒株meq基因編碼的Meq蛋白的主要分子特征為:77E，80Y，115A，139A

6、，176R和217A;對(duì)meq的遺傳進(jìn)化分析表明中國(guó)商品蛋雞或種雞群中流行的MDV具有遺傳進(jìn)化多樣性，meq基因存在新的變異。
　　為研究中國(guó)MDV流行毒株的致病特征以及MDV混感REV對(duì)SPF雞的影響，選取具有中國(guó)流行毒株meq基因典型特征、且臨床發(fā)病率高和死亡率高的3株MDV分離毒（LCC，LLY和LTS株），以及1個(gè)MDV和REV混感培養(yǎng)物進(jìn)行了致病性分析。結(jié)果表明3株MDV野毒株感染的SPF雞各具不同的發(fā)病特征，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)

7、剖檢可見絕大多數(shù)LLY和LTS接種雞發(fā)生明顯的內(nèi)臟腫瘤，而LCC接種雞無肉眼可見腫瘤，但組織病理觀察可見LCC攻毒組雞內(nèi)臟組織發(fā)生腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示不同野毒株誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生時(shí)間是不一致的。3株病毒均能引起SPF雞100％發(fā)病，但是死亡率較低，LCC，LLY和LTS攻毒組雞只死亡率別為42.9％，46.7％和23.1％。MDV和REV的混合培養(yǎng)物-CYM+R卻能引起SPF雞100％的腫瘤率和93.3％的死亡率;組織病理學(xué)觀察可見肝

8、臟、脾臟、腎臟和腺胃等均出現(xiàn)以多形態(tài)的淋巴細(xì)胞增生浸潤(rùn)為主的病灶，這些浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞包括小型、中型和大型淋巴細(xì)胞，取代部分原來的正常組織（腺胃）;免疫組化可見腺胃腺管上皮細(xì)胞呈棕褐染色，分布于整個(gè)纖維組織。這表明MDV與REV混合感染對(duì)雞群的危害更嚴(yán)重。
　　本研究也評(píng)價(jià)了現(xiàn)有MD疫苗(CVI988株)對(duì)MDV流行毒株的免疫保護(hù)效果。免疫后接種MDV LCC，LLY和LTS株的雞只發(fā)病率分別為14.3％、7.7％，和33.3％，M

9、D疫苗（CVI988株）對(duì)它們的免疫保護(hù)指數(shù)分別為85.7，92.3和66.7。表明現(xiàn)有疫苗對(duì)不同MDV流行毒株的保護(hù)效果存在顯著的差異。為研究MDV流行毒株在雞體內(nèi)的復(fù)制能力及疫苗對(duì)野毒株復(fù)制的干擾能力，通過熒光定量PCR法動(dòng)態(tài)檢測(cè)了羽髓中病毒的載量。結(jié)果表明LCC和LTS株在攻毒后14和17d病毒載量達(dá)到高峰，每百萬個(gè)宿主細(xì)胞中108個(gè)拷貝數(shù)以上，LLY攻毒在攻毒后17d病毒載量達(dá)到高峰。3株病毒攻毒后21～60d維持在106個(gè)/拷

10、貝數(shù)百萬個(gè)宿主細(xì)胞以上，均顯著高于免疫攻毒組的病毒載量(P≤0.05)。免疫后LTS攻毒雞在17～21d也能達(dá)到每百萬個(gè)宿主細(xì)胞中106個(gè)拷貝數(shù)以上，而免疫后LCC和LLY攻毒組病毒載量在106個(gè)拷貝以下。CVI988對(duì)LTS株在體內(nèi)復(fù)制的干擾能力較低，這可以部分解釋疫苗保護(hù)水平低的原因。利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)，對(duì)MDV和REV的混合培養(yǎng)物CYM+R中的MDV進(jìn)行分子純化，獲得一株純凈的MDV毒株，并通過二代全基因組測(cè)序分析其全病毒基因

11、組。遺傳進(jìn)化樹分析表明該株MDV毒株表現(xiàn)出與中國(guó)流行毒株具有非常接近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，并未有明顯的進(jìn)化。表明MDV和REV的混合培養(yǎng)物-CYM+R的高致病能力并不是其中的MDV毒株發(fā)生顯著進(jìn)化造成的，更有可能是由于其于REV混合感染的結(jié)果。
　　綜上所述，本研究對(duì)MDV的流行情況進(jìn)行了廣泛的調(diào)查和分析，對(duì)MDV流行毒株的分子特征、遺傳進(jìn)化規(guī)律、致病特征、體內(nèi)復(fù)制特點(diǎn)和現(xiàn)有MD疫苗對(duì)流行毒株的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的研究和分析