Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽對(duì)Rhizopus stolonifer作用機(jī)理研究.pdf

1、桃軟腐病菌（Rhizopus stolonifer）是果蔬采收后的主要病原菌，常引起貯藏、運(yùn)輸和銷售中的大量爛果，損失嚴(yán)重。由于長期使用殺蟲劑，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗藥性。同時(shí)，隨著人們對(duì)農(nóng)藥殘留問題越來越關(guān)注，許多生產(chǎn)上常用的殺菌劑已被明令禁止使用。因此，尋求安全、無毒、經(jīng)濟(jì)、有效的控制采后果蔬腐爛的方法成為當(dāng)務(wù)之急。Bacillussubtilis在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生不同種類的抗菌物質(zhì)，由于Bacillus subtilis抗菌物質(zhì)抑菌

2、譜廣、抗菌效果強(qiáng)，因此在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和輕工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 近幾年來，本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株食品源的Bacillus subtilis fmbJ，該菌株產(chǎn)生的抗微生物活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和部分酶穩(wěn)定性，抗菌譜廣，抗微生物活性高。前期研究表明該微生物活性物質(zhì)主要為surfactin和fengycin，均為環(huán)狀脂肽。目前關(guān)于脂肽對(duì)桃軟腐病菌的作用機(jī)理尚未闡明，surfactin與fengycin在抑菌過程中的相互關(guān)系

3、也未見報(bào)道。因此，本論文主要對(duì)該菌株產(chǎn)生的脂肽對(duì)桃軟腐病菌的作用機(jī)理進(jìn)行研究，同時(shí)從不同的角度研究surfactin與fengycin在抑菌過程中的相互關(guān)系，得到以下研究結(jié)果：
　　 1.對(duì)Bacillus subtilis fmbJ發(fā)酵產(chǎn)的脂肽進(jìn)行ESI-MS/CID分析表明，在所設(shè)定的液相洗脫條件下，surfactin的出峰時(shí)間為17.5-24.5min，fengycin的出峰時(shí)間為24.5-32.2min.通過對(duì)發(fā)酵不同時(shí)

4、間的脂肽提取物進(jìn)行高效液相色譜分析和抑菌活性測(cè)定得出，發(fā)酵50小時(shí)時(shí)，脂肽的產(chǎn)量最高.此時(shí)樣品中fengycin與surfactin的濃度比為5:1.
　　 2.F：S=5:1（濃度比）和F：S=1:1的兩種脂肽組合對(duì)桃軟腐病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢能力都具有抑制作用。F：S=5:1的脂肽組合對(duì)桃軟腐病菌孢子的最小抑菌濃度（MIC）為fengycin0.4mg/mL，最小致死濃度（MFC）為fengycin1.4mg/mL，

5、對(duì)菌絲的有效抑制中濃度（EC50）為fengycin27.68μg/mL。F：S=1:1的脂肽組合對(duì)桃軟腐病菌孢子的MIC為fengycin2.0mg/mL，MFC為fengycin6.5mg/mL，對(duì)菌絲的EC50為fengycin98.12μg/mL。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩種脂肽組合作用后不但可引起菌絲表面形態(tài)的變化，還可穿過細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。比較兩種脂肽組合的抑菌效果得出，surfactin可降低fengeyi

6、n對(duì)桃軟腐病菌的抑制作用。
　　 3.通過檢測(cè)細(xì)胞外紫外吸收物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸以及K+的泄露，結(jié)合PI染色得出，脂肽可改變桃軟腐病菌細(xì)胞膜的通透性，破壞其完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，引起細(xì)胞的快速死亡.31PNMR研究脂肽與模擬細(xì)胞膜的相互作用發(fā)現(xiàn)，脂肽可破壞細(xì)胞膜中磷?；慕Y(jié)構(gòu).另外，surfactin可降低fcngycin對(duì)磷?；钠茐某潭取?br>　　 4.通過紫外光譜掃描和凝膠阻滯試驗(yàn)可知，兩種脂肽組合在細(xì)胞外無法與桃軟