Bacillus amyloliquefaciens M1菌株生產(chǎn)的抗菌脂肽對(duì)耐藥性海洋病原弧菌抑菌活性的研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)在其生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)生多種脂肽類物質(zhì),具有顯著的抗細(xì)菌、抗真菌和抗支原體活性?？咕氖怯芍舅徭満碗逆渻刹糠謽?gòu)成,兼具親水性和疏水性,這類物質(zhì)種類多樣,結(jié)構(gòu)各異?？咕脑谵r(nóng)業(yè)生物防治、醫(yī)藥和環(huán)境治理等多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)具有巨大的應(yīng)用潛力?？咕木哂袕V泛的抑菌活性,但是否對(duì)海洋病原弧菌有抑制作用呢?海洋動(dòng)物弧菌病會(huì)對(duì)海水養(yǎng)殖造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過使用抗生素來防治海

2、洋動(dòng)物弧菌性疾病,但抗生素容易使海洋環(huán)境中的微生物產(chǎn)生耐藥性,破壞海洋菌群的平衡。所以亟需尋找一種能殺死耐藥性病原弧菌的,天然且安全的抑菌物質(zhì)來防治海洋動(dòng)物的弧菌性疾病。
　　本研究中,M1菌株是一株分離自紅樹林的菌株,其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌活性。利用常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)M1菌株進(jìn)行鑒定,該菌株被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens),這是一株在實(shí)際應(yīng)用中比較安全的細(xì)菌。M1菌株可以對(duì)9種常見

3、的具有耐藥性的海洋病原弧菌產(chǎn)生抑菌活力。
　　為了降低M1菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的生產(chǎn)成本,利用廉價(jià)原料優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基。最佳發(fā)酵條件為:豆餅粉1.0％(w/v),面粉1.5%(w/v),pH7.0,培養(yǎng)溫度為28℃,180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。完成了M1菌株在10-L發(fā)酵罐中的發(fā)酵實(shí)驗(yàn),M1菌株在發(fā)酵培養(yǎng)21 h時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期,菌體量達(dá)到1.6×109 cells/mL,在第18 h時(shí)抑菌活力最大,抑菌圈直徑為34.0 mm、并測(cè)

4、定了淀粉酶活力(最高為48.7 U/mL)和蛋白酶活力(最高為2.3 U/mL)隨時(shí)間變化規(guī)律。通過酸沉淀、甲醇抽提,薄層層析和高效液相色譜法(HPLC)等手段對(duì)發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了分離和純化,獲得了抑菌物質(zhì)NQ。質(zhì)譜分析表明,抑菌物質(zhì)NQ是表面活性素(surfactin),由Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu分別連接C12、C13、C14和C15的β-羥基脂肪酸構(gòu)成的環(huán)狀脂肽。純化后的抗菌脂肽NQ最適作用溫

5、度是28℃,在20℃-40℃之間都有良好的穩(wěn)定性;在pH7.0-9.0之間抗菌脂肽的穩(wěn)定性較好,其最小抑菌濃度為12.5μg/mL。
　　對(duì)M1菌株純化后的抗菌脂肽的抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探究:純化后的抗菌脂肽不僅可以殺死完整的鰻弧菌細(xì)胞,還能殺死鰻弧菌細(xì)胞的原生質(zhì)體,這說明抗菌脂肽可能是通過破壞細(xì)胞膜來殺死細(xì)菌的。電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),被抗菌脂肽作用過的鰻弧菌細(xì)胞表面出現(xiàn)破損,細(xì)胞出現(xiàn)降解,細(xì)胞內(nèi)容物釋放,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,說明抗菌脂肽能破壞鰻弧