應(yīng)用精子載體法體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬胚胎的技術(shù)研究.pdf

1、本研究探討了精子載體法體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的多個影響因素，嘗試應(yīng)用SMGT+IVF和SMGT+ICSI生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎，以期建立一個高效的以豬精子為載體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，為將來轉(zhuǎn)基因豬的商業(yè)化奠定科研基礎(chǔ)。
　　 第一部分通過對SMGT+IVF法體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的研究，探討了洗精液、外源DNA孵育時間、孵育溫度三個因素對轉(zhuǎn)基因胚胎后期發(fā)育的影響。試驗一探討了不同洗精液處理精子后對豬轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明：PFM洗滌處理組發(fā)

2、育到2-細(xì)胞和8-細(xì)胞胚胎的比例都高于DPBS組和對照組(67.90％Vs.60.76％和63.10％，27.16％Vs.15.19％和22.62％)；而三組胚胎的囊胚發(fā)育率之間差異不顯著，以PFM處理組效果較好。試驗二研究了外源DNA與精子孵育時間對豬胚胎發(fā)育的影響：30min、lh、2h和3h組別之間胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞、8-細(xì)胞的比例和囊胚發(fā)育率差異沒有顯著差異，孵育2h組得到2.85％的陽性胚胎率。試驗三關(guān)于不同孵育溫度對豬胚胎發(fā)

3、育的影響結(jié)果表明：外源DNA與精子孵育26℃組的2-細(xì)胞率、囊胚率、陽性胚胎率都是最高的，分別為61.54％、12.31％和3.08％，其8-細(xì)胞期的胚胎比例(35.38％)顯著高于17℃和38.5℃組(17.91％和18.84％，P<0.05)。
　　 第二部分試驗通過在體外預(yù)先處理好豬精子，再將豬精子與外源DNA(pPGK l-Fat l-EGFP)在一定條件下進(jìn)行孵育，探討精子載體法在體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬胚胎的應(yīng)用。試驗一精子

4、質(zhì)膜完整性對轉(zhuǎn)基因豬胚胎發(fā)育影響的結(jié)果表明，可以通過不同方法對精子質(zhì)膜的檢驗；凍融精子SMGT+ICSI的效率達(dá)到14.74％，顯著高于活精子組3.45％(P<0.05)。試驗二探討了操作臺的溫度對豬ICSI胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明：注射臺碰度38.5℃組得到的8-胞率是42.03％,顯著高于26℃和32℃(25.00％和22.86％,P<0.05)；385℃組得到8.70％的陽性胚胎率。試驗三探討了6-DMAP不同處理時間對轉(zhuǎn)基因豬胚

5、胎發(fā)育的影響：3h組的2-細(xì)胞率、8-細(xì)胞率、囊胚率核陽性胚胎率分別為50.67％、24.00％、13.33％和5.33％，高于2h、4h、5h組；各試驗組(2h、3h、4h、5h)之間差異不顯著，但顯著差異于對照組(P<0.05)。試驗四是應(yīng)用精子載體法體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬胚胎，結(jié)果表明SMGT+ICSI法得到的4-細(xì)胞率、8-細(xì)胞率和陽性胚胎率分別為58.11％、37.84％和9.46％，高于SMGT+IVF組和對照組；其囊胚率顯著高于