綿羊卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究.pdf

1、羊胚胎體外生產(chǎn)及卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)，對(duì)于保護(hù)品種資源、促進(jìn)胚胎移植技術(shù)的商業(yè)化以及為克隆、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)研究提供技術(shù)平臺(tái)均具有重要意義。為此。本試驗(yàn)開展了該方面的研究，主要結(jié)果如下： 提高綿羊胚胎體外生效率的研究結(jié)果表明：超排6～8周齡羔羊，每只平均獲卵母細(xì)胞數(shù)(60.8枚)顯著性高于12～14周齡羔羊(27.3枚)(P<0.05)；采用低溫保存精液上游法制備精子進(jìn)行體外受精的卵裂率(78.4％)顯著性高于冷凍精液上游法和P

2、ercoll離心法(23.4％和62.8％)(P<0.05)；采用無(wú)葡萄糖發(fā)育液培養(yǎng)早期胚胎的桑椹胚率(33.4％)顯著性高于含1.5mmol/L葡萄糖發(fā)育液(17.4％)(P<0.05)。 采用OPS法玻璃化冷凍保存屠宰場(chǎng)來(lái)源的綿羊體外成熟卵母細(xì)胞(冷凍組)，其解凍后的孤雌激活卵裂率為64.2％，顯著性低于毒性組(76.7％)和對(duì)照組(79.1％)(P<0.05)，冷凍組和毒性組孤雌胚胎發(fā)育到囊胚的比例(4.2％和5.8％)顯

3、著性低于對(duì)照組(20.2％)(P<0.05)：卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精的卵裂率和囊胚發(fā)育率，冷凍組(67.6％、7.1％)和毒性組(62.3％、9.1％)均顯著性低于對(duì)照組(78.4％、28.4％)(P<0.05)。采用OPS法冷凍保存超排羔羊卵母細(xì)胞，其解凍后進(jìn)行體外受精的卵裂率和桑椹胚發(fā)育率(67.8％和35.6％)顯著性低于對(duì)照組(79.2％和53.8％)(P<0.05)：將冷凍組所生產(chǎn)的52枚桑椹胚進(jìn)行胚胎移植，成功產(chǎn)下4只健康羔羊

4、。 冷凍保存對(duì)精子穿卵、卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒分布、酶溶解透明帶時(shí)間、雌原核形成影響的研究結(jié)果表明：?jiǎn)尉尤肼崖?，冷凍組(28.2％)和毒性組(29.3％)顯著性低于對(duì)照組(45.0％)(P<0.05)，毒性組與冷凍組無(wú)顯著性差異(P>0.05);皮質(zhì)顆粒呈完全釋放的比例，在IVM24h和IVm26h，毒性組(41.2％和40.8％)和冷凍組(41.7％和51.8％)顯著性高于對(duì)照組(7.1％和18.4％)(P<0.05)；IVM2

5、6h酶溶解透明帶時(shí)間，毒性組(435.6±16.6s)和冷凍組(422.3±14.6s)顯著性長(zhǎng)于對(duì)照組(381.6±15.3s)(P<0.05)；雌原核形成率，冷凍組(63.9％)和毒性組(58.7％)組顯著性高于對(duì)照組(8.2％)(P<0.05)?？梢?jiàn)，玻璃化冷凍液孤雌激活體外成熟綿羊卵母細(xì)胞，引起CG提前釋放，導(dǎo)致透明帶變硬，從而降低精子穿卵，是導(dǎo)致冷凍保存降低卵母細(xì)胞受精能力的原因。 抗凍保護(hù)劑(15％DMSO、15％E