豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的初步研究.pdf

1、豬是進(jìn)行人類異種器官移植研究的理想動(dòng)物，而研究異種器官移植需對(duì)早期胚胎進(jìn)行遺傳操作，和體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎相比，目前豬胚胎體外生產(chǎn)效率不高，因此急需優(yōu)化胚胎體外生產(chǎn)的條件.成熟卵母細(xì)胞移核后激活是核移植的關(guān)鍵步驟之一，卵母細(xì)胞激活率的高低直接影響核移植的效率.當(dāng)前核移植效率低下，其原因之一就是受體卵母細(xì)胞未被充分激活。本試驗(yàn)對(duì)影響豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)、孤雌激活、體外受精及克隆胚移植的因素進(jìn)行了研究，以便確立胚胎體外生產(chǎn)的最佳條件。

2、本文研究了季節(jié)變化對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟、孤雌激活胚體外發(fā)育能力及體細(xì)胞克隆胚移植后體內(nèi)發(fā)育能力的影響.比較不同季節(jié)平均每個(gè)卵巢獲得的A級(jí)卵的數(shù)量及卵母細(xì)胞核成熟的比例，統(tǒng)計(jì)分析不同季節(jié)核移植胚胎發(fā)育能力的差異，我們發(fā)現(xiàn)在春季移植克隆胚胎無(wú)論妊娠還是出生率都高于夏季和冬季.這可能是因?yàn)橄募竞投镜臏囟冗^(guò)高或過(guò)低對(duì)運(yùn)輸和胚胎移植操作過(guò)程中的克隆胚胎影響較大，特別是我們移植的1-2細(xì)胞期克隆胚胎。研究了放線菌酮預(yù)處理對(duì)豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程和孤

3、雌激活后原核形成的影響。結(jié)果表明：放線菌酮( CHX)預(yù)處理卵母細(xì)胞可有效抑制其生發(fā)泡破裂( CVBD)的發(fā)生，在解除抑制后減數(shù)分裂可完全恢復(fù)。培養(yǎng)441詬，TCM199+CHX組卵母細(xì)胞的激活率較低，但是差異不顯著(P>0.05)。 多次孤雌激活試驗(yàn)表明，去卵丘卵母細(xì)胞最佳電激活參數(shù)為120v/mm，40μs，1DC。乙醇單獨(dú)激活顯著低于7.5μg/mL細(xì)胞松弛素B(CB)+10μg/mL CHX、7.5μg/mLCB+2Mm

4、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)或7.5μg/mLCB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP聯(lián)合激活組(P<0.05)。其中7.5μg/mlCB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP組卵母細(xì)胞激活后嚢胚發(fā)育率最高。電激活前用乙醇預(yù)處理卵母細(xì)胞，電激活后與不同的化學(xué)激活劑聯(lián)合處理，結(jié)果表明乙醇( Ethanol)+電脈沖(DC pulse)組卵母細(xì)胞的囊胚率顯著低于Ethanol+DC pulse+CHX，Ethanol+DC

5、 pulse+6-DMAP，Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP組(P<0.05)，Ethanol+DC pulse+CHX+6-DMAP組顯著高于其它各組(P<0.05).電激活單獨(dú)處理組卵母細(xì)胞囊胚率顯著低于電激活與化學(xué)激活聯(lián)合處理組(P<0.05)。其中DC pulse+CHX+6-DMAP組顯著高于DC pulse+CHX，DCpulse+6-DMAP組。卵母細(xì)胞在含CHX(10mg/mL)的NCSU-23中預(yù)

6、處理lOmin獲得的裘胚率最高(25％)，顯著高于預(yù)處理Omin、30min、40min組(12.3％、17.1％、4.9％，P<0.05).試驗(yàn)結(jié)果表明電激活前，用CHX預(yù)處理較短時(shí)間可提高體外成熟卵母細(xì)胞孤雌激活胚的發(fā)育能力。 以解凍后活力為0.3左右的冷凍精液進(jìn)行體外受精時(shí)，精子濃度以107為宜；0.25mL細(xì)管冷凍精液IVF的卵裂率顯著低于鮮精，但是囊胚率差異不顯著；多精入卵率隨著共孵時(shí)間或精子濃度的增長(zhǎng)而增加，精卵共孵