慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因雞模型系統(tǒng)在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如作為生物反應(yīng)器在雞蛋中表達功能蛋白、禽類育種及用于胚胎發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究等。本研究的主要目的是探索并建立基于HIV-1慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)體系，初步生產(chǎn)表達人類藥用蛋白——組織纖溶酶原激活劑(tPA)轉(zhuǎn)基因雞，并建立輸卵管特異表達啟動子篩選體系，為今后輸卵管生物反應(yīng)器的開發(fā)應(yīng)用及轉(zhuǎn)基因育種作預(yù)備。 為研究方便，首先以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)為標記基因構(gòu)建了基于HI

2、V-1的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，并生產(chǎn)病毒(病毒滴度10<'6>個轉(zhuǎn)染單位/ml)，。病毒感染不同來源、不同分化特征的細胞，在所有類型細胞中均可檢測到EGFP較高水平的表達，其中在Hela、293FT細胞中的轉(zhuǎn)染效率約為10<'8>轉(zhuǎn)染單位/ml，C127中為5×10<'7>轉(zhuǎn)染單位/ml，，雞胚胎成纖維(CEF)約10<'6>轉(zhuǎn)染單位/ml，病毒在雞原生殖細胞中轉(zhuǎn)染效率最低為10<'2>轉(zhuǎn)染單位/ml。病毒的感染可引起細胞表型的不利改變

3、。用該病毒注射雞囊胚獲得了綠色熒光信號可直接活體觀察的轉(zhuǎn)基因雞。試驗中分兩次共注射204只雞胚，孵化出30只，孵化率15％，其中16只經(jīng)點雜交分析及PCR分析有外源基因的整合，轉(zhuǎn)基因效率53％，在其中兩個雄性轉(zhuǎn)基因個體的后代中發(fā)現(xiàn)了外源基因的整合，表明發(fā)生了生殖嵌合現(xiàn)象。在活體中有4只可從體表通過激發(fā)熒光而直接觀察到綠色熒光信號。熒光信號在不同個體、不同的體表部位表現(xiàn)出不同的表達特征，多呈點狀分布，主要集中在喙及雞冠兩側(cè)、鼻、耳、爪等皮

4、膚裸露處，前胸、面部等羽毛稀疏處。進一步解剖分析表明，外源基因在不同組織中的表達強度、表達特性是不一樣的，尤以大、小腸中的表達最為強烈為彌散型分布，而在肝臟中發(fā)現(xiàn)非均質(zhì)點狀分布。在成年個體皮膚、肝臟、胰臟、小腸及血管的組織切片中也發(fā)現(xiàn)了強烈的綠色熒光信號，最為重要的是在睪丸中也發(fā)現(xiàn)了強烈的熒光信號，綠色熒光集中于睪丸曲細精管管周。同時試驗中還初步探索了以LM-PCR方法分析外源基因整合位點的可行性。以上結(jié)果表明基于HIV-1的慢病毒載體

5、可以較低的費及較低的設(shè)備要求用于高效制備轉(zhuǎn)基因家禽。 在前者研究基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了表達人類組織型纖溶酶原激活劑的慢病毒載體，在載體中tPA和綠色熒光蛋白以Asp-Pro蟻酸敏感位點結(jié)成融合蛋白。用病毒共注射了34只雞胚，孵化出7只，孵化率20.6％，其中兩只經(jīng)PCR及點雜交方法檢測有外源基因的整合，兩只個體均為雄性。由于蛋白融合后可能會影響GFP蛋白的熒光表達，在兩只轉(zhuǎn)基因個體的體表均沒有發(fā)現(xiàn)直接可視的綠色熒光信號，但經(jīng)免疫熒

6、光分析后在其中一只個體的胰腺中發(fā)現(xiàn)了較弱的目的蛋白的表達。用F板檢驗法，在轉(zhuǎn)基因雞胰臟及肝臟中檢測到tPA重組蛋白有較高的生物酶活性的。家禽作為生物反應(yīng)器表達藥用蛋白最為人關(guān)注同時也最能表現(xiàn)其生產(chǎn)應(yīng)用價值的地方是實現(xiàn)在輸卵管中的特異/高效表達。而實現(xiàn)這一目標的關(guān)鍵是篩選合適的啟動子。為此克隆了SV40大T抗原(TAG)基因全序列，并構(gòu)建了表達TAG的neo抗性慢病毒載體，生產(chǎn)病毒后，侵染新開產(chǎn)蛋雞輸卵管上皮原代培養(yǎng)細胞，篩選建立了永生化

7、輸卵管上皮細胞，經(jīng)永生化后細胞的增殖能力有所改善。以此為基礎(chǔ)評價不同啟動子的表達效果。共克隆并構(gòu)建了兩種含有不同長度卵清蛋白(OV)啟動子的Blasticidin抗性慢病毒載體，啟動子分別為OV1345及OV2964，兩種啟動子除后者多了第一內(nèi)含子外其余序列均相同。兩種病毒感染永生化輸卵管上皮細胞后，經(jīng)篩選穩(wěn)定整合細胞后，提取DNA及mRNA分別進行定量分析，結(jié)果表明從DNA整合效果上看，含OV1345啟動子的病毒是含OV2964啟動子