乳腺癌HER2-neu基因熒光原位雜交診斷體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患病率在全球呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康，因此對(duì)乳腺癌進(jìn)行有效的診斷和合理的治療顯得尤為重要。在乳腺癌患者中，大約有20％-30％的患者有HER2/neu基因的擴(kuò)增和(或)過(guò)表達(dá)，由于HER2/neu基因的擴(kuò)增和(或)過(guò)表達(dá)同乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，并對(duì)臨床治療有指導(dǎo)作用，因此美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)(ASCO)和美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)建議所有乳腺癌患者的HER2/neu基因狀態(tài)都應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。目前通

2、過(guò)FDA認(rèn)證的檢測(cè)方法是IHC和FISH，而IHC是臨床和實(shí)驗(yàn)室使用最多的檢測(cè)方法，但是該方法判讀時(shí)主觀性強(qiáng)，抗體差異常導(dǎo)致結(jié)果的不同，使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較差。FISH被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是檢測(cè)HER2/neu水平的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它具有直接對(duì)基因進(jìn)行定量檢測(cè)，判讀客觀，可以區(qū)分HER2蛋白中度陽(yáng)性(IHC結(jié)果為2+)的患者等特點(diǎn)，但目前由于市場(chǎng)上只有國(guó)外探針試劑盒銷(xiāo)售，其費(fèi)用昂貴，限制了該方法在國(guó)內(nèi)臨床的應(yīng)用。因此臨床迫切需要我國(guó)自主研發(fā)的試

3、劑盒。本研究的目的是建立檢測(cè)乳腺癌HER2基因狀態(tài)的熒光原位雜交診斷體系，通過(guò)對(duì)不同病理類(lèi)型的原發(fā)性乳腺癌患者組織中HER2/neu基因狀態(tài)的定量分析，初步了解HER2/neu基因在整個(gè)乳腺癌患者中的擴(kuò)增率，探討HER2/neu基因狀態(tài)同乳腺癌各種臨床，病理和生物學(xué)因素的相關(guān)性；比較IHC法和FISH兩種方法之間的一致性和相關(guān)性以及優(yōu)缺點(diǎn)，制定最為合理的乳腺癌診斷治療策略。
　　 材料和方法：
　　 1.研究對(duì)象：本實(shí)驗(yàn)

4、從2006年1月-2008年12月共收集了5例腫瘤組織毗鄰的正常乳腺組織石蠟包埋切片，50例在病理學(xué)上確診為原發(fā)性乳腺癌的初治患者的石蠟包埋切片。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)17號(hào)染色體著絲粒序列設(shè)計(jì)合成特異的引物和探針，使用ARESAlexaFluor488DNAlabelingkit制備17號(hào)染色體著絲粒區(qū)熒光原位雜交探針。對(duì)所選BAC克隆進(jìn)行切口平移標(biāo)記熒光素，制備HER2/neu基因特異的熒光原位雜交探針。使用外周血和SK

5、-BR-3人乳腺腺癌細(xì)胞對(duì)兩種探針的特異性，靈敏度等進(jìn)行分析。對(duì)石蠟組織切片的蛋白酶K消化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，建立熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)HER2/neu基因狀態(tài)的診斷體系。收集50例不同類(lèi)型的乳腺癌患者的石蠟包埋切片標(biāo)本，用已建立的熒光原位雜交(FISH)法進(jìn)行檢測(cè)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：兩種方法的獨(dú)立性檢驗(yàn)以及檢測(cè)結(jié)果同各因素之間的相關(guān)性采用x2檢驗(yàn)，若不能滿足x2檢驗(yàn)條件則采用Fisher確切概率法。
　　 實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果：
　　 1.熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)HER2/neu方法的成功建立。
　　 制備的探針特異性高，點(diǎn)的亮度佳，鏡下易于清晰辨認(rèn)，且雜交率高，90％的細(xì)胞雜交理想。
　　 2.石蠟包埋組織切片蛋白酶K消化時(shí)間的確定
　　 消化15-20分鐘后，背景干凈，細(xì)胞界限清楚，細(xì)胞形態(tài)清晰，雜交后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)清晰的兩個(gè)紅點(diǎn)，信號(hào)強(qiáng)度好，容易分辨計(jì)數(shù)。故可以確定20mg/ml的蛋白酶K對(duì)石蠟包埋組織切片的理想消

7、化時(shí)間為15-20分鐘。
　　 3.臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果
　　 3.1乳腺癌患者HER2/neu，雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)的免疫組化檢測(cè)
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)50例乳腺癌患者組織標(biāo)本的HER2/neu基因，雌激素受體和孕激素受體狀態(tài)進(jìn)行了病理檢測(cè)。結(jié)果為，在乳腺癌組織中，HER2/neu無(wú)過(guò)表達(dá)的有29例，表達(dá)在2+以上的病例數(shù)有21例，過(guò)表達(dá)比例為42％；ER表達(dá)正常33例，異常表達(dá)17例；PR表達(dá)正常29

8、例，異常表達(dá)21例。
　　 3.2乳腺癌患者HER2/neu基因的檢測(cè)結(jié)果
　　 在50例乳腺癌中有19例患者有HER2/neu基因擴(kuò)增(38％)，與免疫組化檢測(cè)HER2/neu蛋白結(jié)果具有同一性(86％，P＜0.05)，其中在ER表達(dá)陽(yáng)性的患者中有3例HER2/neu基因擴(kuò)增，16例無(wú)擴(kuò)增；在PR陽(yáng)性的患者中有5例HER2/neu基因擴(kuò)增，14例無(wú)擴(kuò)增；在19例HER2/neu基因擴(kuò)增的患者中有18例屬于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，

9、1例屬于浸潤(rùn)性小葉癌；在年齡≤50歲的患者中有7例有HER2/neu基因的擴(kuò)增，在年齡＞50歲的患者中有12例有HER2/neu基因的擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明HER2/neu基因的擴(kuò)增同ER的表達(dá)之間具有相關(guān)性，而與PR的表達(dá)狀態(tài)，腫瘤的病理分型，年齡無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功制備了17號(hào)染色體著絲粒區(qū)和HER2/neu特異位點(diǎn)探針，建立了熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)HER2/neu基因狀態(tài)體系。
　　 2

10、.免疫組化檢測(cè)HER2/neu蛋白表達(dá)狀態(tài)同熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)HER2/neu基因狀態(tài)具有同一性(86％，P＜0.05)。
　　 3.在38％的乳腺癌患者中存在HER2/neu基因的擴(kuò)增。
　　 4.乳腺癌患者HER2/neu基因的擴(kuò)增與ER的狀態(tài)具有相關(guān)性，同PR的狀態(tài)，年齡，腫瘤的病理類(lèi)型沒(méi)有相關(guān)性。
　　 5.熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)HER2/neu基因的擴(kuò)增具有特異性、靈敏性高，穩(wěn)定性好