hpRNA的莖環(huán)比例對RNA介導的病毒抗性產生的影響.pdf

1、RNA介導的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一種表現形式,侵入植物細胞的病毒基因組與轉基因轉錄產物具有部分同源性,因此在PTGS所導致的RNA降解過程中,RNA降解系統識別侵入細胞內的病毒基因組并將其與轉基因RNA一起降解。 新的研究證明發(fā)生于不同物種上的RNA沉默的直接引發(fā)因子都是雙鏈RNA(double strded RNA,dsRNA),在不同生物中dsRNA有多種形成方式。對于轉基因(正義和反義)來說,dsRNA最

2、有效的形成途徑是體外構建具有反向重復結構(Inverted Repeat,IR)的cDNA引入轉基因植株,這種IR結構在體內轉錄后形成發(fā)夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)。hpRNA中的dsRNA部分決定了反應的特異性,是誘發(fā)基因沉默的關鍵部位。它的長度和來源均影響所誘導的RNA沉默的效率。hpRNA間隔區(qū)段的長度可影響轉基因轉錄后hpRNA的形成和穩(wěn)定性,進而影響基因沉默的效率。一般認為短的間隔序列有利于hpRNA的形成,

3、保持其高度穩(wěn)定性,獲得較高的沉默效率；但研究中也發(fā)現間隔序列過短往往影響IR序列在細菌內的穩(wěn)定性,影響具反向重復結構基因的克隆。適宜的莖環(huán)比例,可能是獲得高基因克隆效率和高基因沉默效率的關鍵。 本研究選用了PVYNCP基因3'端sob序列作為hpRNA的莖,以克隆載體pUC19不同長度的序列為環(huán),構建了具有不同莖環(huán)比例的hpRNA結構的植物表達載體,轉化煙草,研究了莖環(huán)比例對RNA介導的病毒抗性產生的影響。研究結果將為高效hpR

4、NA的設計提供依據。具體結果如下： 1.分別克隆PVYNCP 3'端704-754之間50bp的片斷作為hpRNA結構的莖,以pUC19序列上的部分片段為hpRNA的環(huán),構建植物雙元表達載體pROK-4:1、pROK-2:1、pROK-1:1、pROK-1:2、pROK-1:4和pROK-1:8。 2.將所構建的重組植物表達載體pROK-4:1、pROK-2:1、pROK-1:1、pROK-1:2、pROK-1:4和pR

5、OK-1:8及空pROKⅡ利用凍融法直接導入農桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質粒均已成功導入農桿菌菌株。 3.葉盤法轉化煙草NC89。用卡那霉素對再生植株再次抗性篩選、PCR檢測,共獲得轉pROK Ⅱ的煙草40株。轉pROK-4:1的煙草143株,轉pROK-2:1的煙草152株,轉pROK-1:1煙草130株,轉pROK-1：2的煙草135株；轉pROK-:4的煙草132株；轉pROK-1:8的煙草126株。

6、 4.轉基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液為接種物,汁液摩擦接種轉基因煙草。癥狀觀察及ELISA檢測表明不同的轉基因植株對PVYN的抗性存在差異。從抗病性測試結果來看,在143株轉pROK-4:1的T0代煙草中,有84株表現高度抗病,抗性植株比例為57.34％；152株轉pROK-2:1的T0代煙草中,有94株表現高度抗病,抗性植株比例為61.84％；130株轉pROK-1:1的T0代煙草中,有78株表現高度抗病,抗性植株比例

7、為60.00％：135株轉pROK-1:2的T0代煙草中,有69株表現高度抗病,抗性植株比例為51.11％；132株轉pROK-1:4的T0代煙草中有72株表現高度抗病,抗性植株比例為44.69％：126株轉pROK-1:8的T0代煙草中有12株表現高度抗病,抗性植株比例為9.52％。從發(fā)病的情況可以看出轉基因植株中抗性植株的比例與莖環(huán)比例呈一定相關性。 5.分別選取抗病性表現不同(抗病和感病)的部分轉基因植株提取總DNA進行S