馬鈴薯Y病毒CP基因不同區(qū)段對(duì)發(fā)夾RNA和人工的miRNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響.pdf

1、基因沉默是生物體長(zhǎng)期以來(lái)形成的一種防御機(jī)制，阻止外源基因、轉(zhuǎn)座因子、病毒等外源核酸的侵入，保護(hù)生物基因組的完整性。小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是沉默RNA的最主要組成部分。RNA介導(dǎo)的病毒抗性（RNA-mediated virusresistance，RMVR）是RNA沉默的一種表現(xiàn)形式，侵入植物細(xì)胞的病毒基

2、因組與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有部分同源性，因此在轉(zhuǎn)錄后基因沉默所導(dǎo)致的RNA降解過(guò)程中，RNA降解系統(tǒng)識(shí)別侵入細(xì)胞內(nèi)的病毒基因組并將其與轉(zhuǎn)基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)。在基因沉默的研究中已發(fā)現(xiàn)“位置效應(yīng)”的存在，siRNA的有效性可能受到靶序列所處的位置影響。在RNA介導(dǎo)的植物病毒抗性研究中，目前尚未見(jiàn)有關(guān)“位置效應(yīng)”的系統(tǒng)報(bào)道。本研究以馬鈴薯Y病毒外殼蛋白為靶基因分別以hpRNA和人工

3、的miRNA兩種方式構(gòu)建RNA干擾的植物表達(dá)載體，系統(tǒng)性的比較PVY CP基因不同區(qū)段對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響，為尋找引發(fā)基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物提供了依據(jù)。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　　 （1）馬鈴薯Y 病毒CP基因不同區(qū)段對(duì)發(fā)夾RNA 介導(dǎo)的病毒抗性的影響將PVY CP基因人工的劃分為16 段各50bp的區(qū)段。通過(guò)PCR 擴(kuò)增，得到相應(yīng)的不同區(qū)段的正向和反向的片段，通過(guò)酶切連入植物表達(dá)載體

4、pROKⅡ中；熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選并獲得hpRNA 結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體pROK-CPs（pROK-CP9～pROK-CP16）。
　　 用成功構(gòu)建的16個(gè)植物表達(dá)載體（另外8個(gè)為吳斌構(gòu)建）瞬時(shí)侵染本生煙驗(yàn)證其有效性，Northern Blot 結(jié)果顯示，16個(gè)植物表達(dá)載體均能在植物體內(nèi)成功表達(dá)產(chǎn)生siRNA，且瞬時(shí)表達(dá)的siRNA能有效地下調(diào)靶基因PVY CP的表達(dá)。
　　 將構(gòu)建的8個(gè)植物表達(dá)載體利用凍融法

5、導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89，經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR 檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因植株。T0 代轉(zhuǎn)基因植株自交，種子置于含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，共得到的pROK-CP9～pROK-CP16 各50 株、62 株、56 株、55 株、45 株、63 株、72 株和55 株T1 代轉(zhuǎn)基因植株?？共⌒苑治霭l(fā)現(xiàn)除了轉(zhuǎn)基因株系pROK-CP1、pROK-CP2、pROK-CP3、pROK-CP4 未獲得抗性植株外，其余12個(gè)轉(zhuǎn)

6、基因株系中抗性植株的比例分別為27.15％、6.27％、67.65％、70.83％、66.01％、61.34％、66.04％、23.59％、11.11％、55.56％、77.78％和67.25％。結(jié)果表明在利用hpRNA 介導(dǎo)的抗PVY 病毒的研究中，以PVY CP基因上的50bp序列為莖足以介導(dǎo)宿主植株的基因沉默的產(chǎn)生，但由于hpRNA 靶位置的差異產(chǎn)生不同的抗病效率，靶向于3′端nt701～nt750 區(qū)段表現(xiàn)最高水平的抗性；且以C

7、P基因3′端為靶序列的hpRNA轉(zhuǎn)基因植株比以5′端為靶序列的植株更能有效地介導(dǎo)對(duì)PVY的抗性。
　　 轉(zhuǎn)基因植株的Northern 雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA 水平上得到了表達(dá)，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類(lèi)型的感病植株，抗性與RNA 積累量呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)病毒抗性是由RNA 介導(dǎo)的；對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的siRNA表達(dá)量的分析，表明植株對(duì)病毒的敏感程度與siRNA 積累量之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。
　　 對(duì)T2 代的轉(zhuǎn)基

8、因植株的抗病性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的抗性轉(zhuǎn)基因植株的后代均表現(xiàn)很強(qiáng)的抗病毒侵染能力，說(shuō)明由hpRNA 介導(dǎo)的PVY 抗性在T2 代植株中能夠穩(wěn)定遺傳。
　　 （2）馬鈴薯Y 病毒CP基因不同區(qū)段對(duì)人工的miRNA 介導(dǎo)的病毒抗性的影響以PVY CP基因的全長(zhǎng)cDNA序列為靶基因，根據(jù)miRNA的特征選取8個(gè)不同的位置，M1（nt96～nt115）、M2（nt140～nt159）、M3（nt322～nt341）、M4（nt380

9、～nt399）、M5（nt475～nt494）、M6（nt567～nt586）、M7（nt679～nt698）和M8（nt735～nt754）為amiRNA的靶區(qū)。選用擬南芥miR319a 前體作為amiRNA表達(dá)的骨架，通過(guò)PCR 擴(kuò)增的方式替代掉原有的pre-miR319a中具有生物學(xué)功能的miRNA和miRNA*，得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物連入植物表達(dá)載體pROKⅡ中。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，

10、篩選并獲得重組表達(dá)載體pROK-amiRcp1～pROK-amiRcp8。
　　 用構(gòu)建的amiRNA表達(dá)載體瞬時(shí)侵染本生煙，Northern Blot 驗(yàn)證其有效性，結(jié)果顯示,8個(gè)amiRNA 植物表達(dá)載體均能在植物體內(nèi)成功表達(dá)amiRNA，且瞬時(shí)表達(dá)的amiRNA能有效地下調(diào)靶PVY CP基因的表達(dá)。
　　 將成功構(gòu)建的amiRNA表達(dá)載體利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。再生植株經(jīng)卡那霉素

11、抗性篩選和PCR 檢測(cè)確定為轉(zhuǎn)基因植株。T0 代自交后，經(jīng)卡那霉素篩選和PCR 鑒定，分別獲得pROK-amiRcp1～pROK-amiRcp8的T1 代轉(zhuǎn)基因植株98 株、96 株、114 株、116 株、117 株、111 株、110 株和116 株?？共⌒越Y(jié)果顯示，表達(dá)靶向于馬鈴薯Y 病毒CP基因的amiRNA 轉(zhuǎn)基因植株能介導(dǎo)對(duì)馬鈴薯Y 病毒的抗性，抗性比例分別為37.68％、50.29％、53.76％、37.75％、29.86

12、％、17.05％、26.27％、64.69％。針對(duì)馬鈴薯Y 病毒CP基因不同區(qū)段設(shè)計(jì)的amiRcps 其轉(zhuǎn)基因植株所介導(dǎo)的抗病性效果之間存在差異，靶向于3′端的amiRcp-8（nt735～nt754）能表現(xiàn)更高水平的抗性。
　　 轉(zhuǎn)基因植株的Northern 雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA 水平上得到了表達(dá)，且植株的抗性與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，表明amiRNA 介導(dǎo)的病毒抗性是由RNA 介導(dǎo)的。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的