家蠶細(xì)小病毒樣病毒非結(jié)構(gòu)基因1-2啟動(dòng)子的活性研究.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori Parvo-likevirus,BmPLN)原稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型(Bombyx mori DensovirustypeⅡ,.mDNV-Ⅱ),是首例動(dòng)物二分病毒。它是引起家蠶濃核癥的重要病原微生物之一。它與家蠶濃核病(BmDNV-Ⅰ)一樣,都感染家蠶的中腸組織圓筒形細(xì)胞。病毒粒子呈二十面體結(jié)構(gòu),無(wú)囊膜,基因組都為單鏈線性的DNA并且都含末端重復(fù)序列。不同的是,該病毒的基因組分為兩個(gè)單鏈DNA分

2、子(VD1,6543bp;VD2,6022bp)且分別獨(dú)立包裝在不同的衣殼中;兩條鏈的末端重復(fù)序列有53bp的末端共有序列(CTS),無(wú)回文序列;并且含有自身編碼的DNA聚合酶。對(duì)兩條單鏈序列的分析顯示VDl包含四個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1/NS2、ORF2/NS、ORF3/VP和ORF4/DNApolymerase),VD2包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFl/NS3、ORF2/Structuralprotein)。其中,非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)有

3、解旋酶超家族的功能域,具有ATP酶活性,解旋酶活性和DNA結(jié)合活性。非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)與染色體復(fù)制起始蛋白dnaA和DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)因子有一定的同源性。而且它們對(duì)病毒的復(fù)制以及基因表達(dá)有很重要的作用。通過(guò)Northern雜交以及5’/3’-RACE顯示,ORF1和ORF2兩個(gè)開(kāi)放閱讀框一個(gè)1.1kb的轉(zhuǎn)錄本中,它們有一個(gè)共同的啟動(dòng)子,推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能同通過(guò)核糖體的選擇性起始的方式進(jìn)行分別翻譯的。根據(jù)該啟動(dòng)子TATA-box(TA

4、TATAA)所在的位置(圖距單位5)將其命名為P5。到目前為止,該啟動(dòng)子的特性還沒(méi)被研究過(guò)。
　　 本研究首先從家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國(guó)鎮(zhèn)江株)基因組中克隆得到一系列不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段,然后構(gòu)建由其驅(qū)動(dòng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染多種昆蟲(chóng)細(xì)胞,用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光,分析了該啟動(dòng)子的活性。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要做了以下五個(gè)方面的研究:(1)克隆得到包含P5全長(zhǎng)以及CTS在內(nèi)的片斷,并分析其核心功能元件

5、;(2)構(gòu)建由P5以及“P5+CTS”驅(qū)動(dòng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,確定末端共有序列CTS是否參與增強(qiáng)或抑制P5的啟動(dòng)子活性;(3)比較P5在昆蟲(chóng)細(xì)胞(BmN、Hi5、Sf9)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Hela)中的活性;(4)構(gòu)建一系列正向和反向截短的P5驅(qū)動(dòng)的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,確定P5的核心功能域;(5)比較P5與其它幾種啟動(dòng)子(BmNPV-ie-1,Bm-actin和3xP3)的活性。
　　 1、BmPLV非結(jié)構(gòu)基因1/2P5啟動(dòng)

6、子的克隆及核心功能元件分析
　　 根據(jù)病毒基因組末端序列特征,設(shè)計(jì)帶唯一酶切位點(diǎn)的引物,以裂解的病毒粒子作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得P5(-1～-236)和“P5+CTS”(-1～-289)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序鑒定。通過(guò)轉(zhuǎn)錄元件搜索系統(tǒng)(TESS)對(duì)P5進(jìn)行分析顯示該236bp區(qū)域內(nèi)存在有一個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)(-184～-191)、TATAbox(-23～-30)以及轉(zhuǎn)錄起始基序TCAGT(-7～-11)等啟動(dòng)子特征序列。
　　

7、 2、通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)分析確定CTS是否參與增強(qiáng)或抑制P5的啟動(dòng)活性
　　 將P5和“P5+CTS”片段分別克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)載體PGL3-Basic上,構(gòu)建成PGL3-P5和PGL3-(P5+CTS)然后與內(nèi)參質(zhì)粒PRL-SV40分別共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系。用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性,結(jié)果表明CTS能降低P5啟動(dòng)子的活性。
　　 3、P5在不同細(xì)胞系中的活性特異性比較
　　 將構(gòu)建好的PGL3-P5與內(nèi)參

8、質(zhì)粒PRL-SV40分別共轉(zhuǎn)染BmN、Hi5、Sf9和Hela細(xì)胞系。結(jié)果顯示P5在BmN和Hi5細(xì)胞中有較高的活性分別是對(duì)照數(shù)值的18倍和16倍,而在Sf9細(xì)胞中活性較低僅是對(duì)照數(shù)值的4倍,P5在Hela細(xì)胞中也有較高的活性約是對(duì)照數(shù)值的16倍。
　　 4、P5啟動(dòng)子的正反向截短序列活性分析
　　 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果,設(shè)計(jì)6對(duì)正反向截短引物以及1對(duì)人工合成的包含TATA-box和CAGT-box在內(nèi)的核心序列,

9、用獲得的7個(gè)截短的序列分別構(gòu)建了PGL3-P5、PGL3-(F/1)、PGL3-(F/2)、PGL3-(F/3)、PGL3-(F/4)、PGL3-(F/5)和PGL3-(coredel)。然后分別與PRL-SV40共轉(zhuǎn)染BmN、Hi5和Sf9細(xì)胞系。結(jié)果表明,-236nt到-206nt間的序列對(duì)P5非常重要,對(duì)它的缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子活性下降到原始活性的36.5%,而TATA-box并不是維持啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性的必要元件,因?yàn)槿笔髥?dòng)子仍存