副豬嗜血桿菌群體基因組測(cè)序、分子分型和耐藥性研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬格拉澤氏病的病原，它通過(guò)單獨(dú)感染和與其他重要豬病病原的共感染或繼發(fā)感染造成豬的嚴(yán)重?fù)p害和死亡，已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。由于早期體外分離培養(yǎng)困難導(dǎo)致對(duì)該菌的研究起步較晚，對(duì)其群體結(jié)構(gòu)、遺傳變異、分型和耐藥等方而的基礎(chǔ)研究非常缺乏。
　　為了獲得HPS的群體結(jié)構(gòu)特征，本研究利用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)首先對(duì)50個(gè)HPS進(jìn)行了全基因測(cè)序

2、，測(cè)序菌株基因組大小2.13-2.49 Mb，GC含量39.38％-39.97％，預(yù)測(cè)基因2078-2417個(gè)/菌。結(jié)果顯示:HPS基因組大小不同，GC含量穩(wěn)定。
　　以SH0165為參考基因組，通過(guò)挖掘并注釋測(cè)序菌株中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、小片段插入缺失（Small InDel）、結(jié)構(gòu)變異(SV)分析HPS的遺傳變異。分析結(jié)果顯示，HPS中存在廣泛的SNP、Small InDel和SV，并在基因編碼區(qū)(CDS)呈優(yōu)勢(shì)分布。

3、在基因編碼區(qū)，SNP主要為同義突變，顯示了純化選擇壓力;Small InDel主要通過(guò)框架改變引起CDS區(qū)變異，在整體水平上呈插入趨勢(shì);SV主要通過(guò)插入、缺失、反轉(zhuǎn)和染色體內(nèi)易位引起變異，絕大多數(shù)菌株缺失突變的數(shù)量均大于插入和反轉(zhuǎn)，顯示了HPS基因大片段的缺失趨勢(shì)。與SH0165基因組比較，測(cè)序樣品中的非同義突變、編碼區(qū)發(fā)生的Small InDel和SV引起了基因變異。KEGG代謝通路分析顯示:這些變異基因主要富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、氨基酸

4、生物合成和碳代謝通路上。
　　綜合使用膠免疫擴(kuò)散(GID)傳統(tǒng)血清定型、多重PCR分子血清定型(mPCR)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)定型HPS田間分離株，探討它們?cè)贖PS流行病學(xué)研究中的定型效力。在100個(gè)HPS中，GID和mPCR分別定型73個(gè)(73％)和93個(gè)(93％)菌株，二者結(jié)果一致性66％。mPCR將GID定型中不可分型(NT)菌株數(shù)從27個(gè)(27％)降至7個(gè)(7％)。莢膜位點(diǎn)分析顯示，HPS莢膜位點(diǎn)型特異區(qū)域存在大量

5、缺失和功能未知序列，這可能是mPCR定型中NT株產(chǎn)生和GID與mPCR定型結(jié)果不一致的原因。MLST分析將53個(gè)HPS分離株歸為36個(gè)序列型(ST)，發(fā)現(xiàn)14個(gè)新的等位基因序列和23個(gè)新的ST。mPCR和MLST比較分析首次證實(shí)，一個(gè)ST歸屬唯一血清型。同一畜群可被不同血清型甚至是同一血清型不同ST菌株感染。血清型4、5、7、8分離株中存在優(yōu)勢(shì)ST。
　　使用基因組學(xué)方法從11個(gè)測(cè)序HPS中預(yù)測(cè)到9種耐藥基因，可產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類、