副豬嗜血桿菌Cpx雙組份系統(tǒng)潛在誘導(dǎo)因子和基因yccA功能的初步探究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是引起豬格拉瑟氏病的病原，一種應(yīng)激環(huán)境條件下侵入體內(nèi)，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)如胸膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為病癥的傳染病。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCS，two-component regulatory system)是細(xì)菌產(chǎn)生環(huán)境應(yīng)答并調(diào)節(jié)基因差異表達(dá)的膜應(yīng)激系統(tǒng)(ESRs，Envelope stress responses)。Cpx雙組份系統(tǒng)是副豬嗜血桿菌膜應(yīng)激系統(tǒng)之一，由組氨酸激酶CpxA和

2、反應(yīng)調(diào)節(jié)子CpxR組成。應(yīng)激環(huán)境誘導(dǎo)Cpx系統(tǒng)激活，CpxR通過(guò)改變基因的轉(zhuǎn)錄水平緩解膜壓力。本課題擬通過(guò)對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)入宿主體內(nèi)面臨的環(huán)境分析，初步探究副豬嗜血桿菌Cpx系統(tǒng)潛在誘導(dǎo)因子及特定因子激活下Cpx系統(tǒng)調(diào)控基因的功能。
　　主要成果如下:
　　1.高滲透壓、重金屬和抗生素可能是Cpx雙組份系統(tǒng)的潛在誘導(dǎo)因子
　　副豬嗜血桿菌定殖豬上呼吸道，感染宿主過(guò)程中面臨環(huán)境不斷變化，如溫度、滲透壓、pH和抗生素等。實(shí)

3、驗(yàn)通過(guò)模擬副豬嗜血桿菌感染過(guò)程中的環(huán)境變化，采用熒光定量檢測(cè)雙組份系統(tǒng)基因cpxA和cpxR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，探索副豬嗜血桿菌Cpx雙組份系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):副豬嗜血桿菌JS0135Cpx雙組份系統(tǒng)的基因cpxA和cpxR在高滲透壓(KCl)，重金屬（銅離子、鐵離子）和抗生素類（慶大霉素、紅霉素）作用下轉(zhuǎn)錄上調(diào)。如慶大霉素刺激時(shí)基因cpxA轉(zhuǎn)錄上調(diào)7倍，基因cpxR轉(zhuǎn)錄上調(diào)12倍;銅離子誘導(dǎo)時(shí)基因cpxA轉(zhuǎn)錄上調(diào)10倍，基因cpxR轉(zhuǎn)

4、錄上調(diào)35倍。表明上述環(huán)境因素可能是副豬嗜血桿菌Cpx雙組份系統(tǒng)潛在誘導(dǎo)因子。
　　2.銅離子誘導(dǎo)下副豬嗜血桿菌JS0135基因yccA和secY轉(zhuǎn)錄上調(diào)
　　銅離子刺激下，副豬嗜血桿菌Cpx雙組份系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)極顯著，那副豬嗜血桿菌JS0135內(nèi)膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況怎樣？我們通過(guò)熒光定量檢測(cè)副豬嗜血桿菌JS0135內(nèi)膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):0.5mM Cu2+刺激下，副豬嗜血桿菌JS0135基因yccA轉(zhuǎn)錄上調(diào)

5、4倍和secY轉(zhuǎn)錄上調(diào)2～3倍，差異顯著。表明銅離子誘導(dǎo)副豬嗜血桿菌內(nèi)膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，基因yccA和secY可能與副豬嗜血桿菌膜銅離子應(yīng)激有一定作用。
　　3.CpxR蛋白結(jié)合基因yccA啟動(dòng)子區(qū)域
　　根據(jù)以上熒光定量結(jié)果，我們推測(cè)銅離子刺激下，副豬嗜血桿菌Cpx雙組份系統(tǒng)蛋白CpxR可能調(diào)控膜銅離子應(yīng)激相關(guān)基因。為驗(yàn)證這個(gè)猜測(cè)，我們通過(guò)熒光定量檢測(cè)基因cpxR缺失副豬嗜血桿菌內(nèi)膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況。同時(shí)將CpxR蛋

6、白原核表達(dá)純化后，采取EMSA實(shí)驗(yàn)探究蛋白CpxR結(jié)合的哪些基因的啟動(dòng)子區(qū)域。熒光定量結(jié)果:編碼通道蛋白tolC轉(zhuǎn)錄上調(diào)15～16倍，差異極顯著，基因yccA轉(zhuǎn)錄下調(diào)0.5～1倍，差異顯著。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果:蛋白CpxR結(jié)合編碼內(nèi)膜蛋白的基因yccA啟動(dòng)子區(qū)域，推測(cè)CpxR蛋白可能調(diào)控基因yccA應(yīng)答慶大霉素的刺激。
　　4.構(gòu)建基因yccA的缺失和互補(bǔ)菌株，初步探究基因yccA的功能
　　首先，以SH0165全基因組為模板

7、設(shè)計(jì)引物和擴(kuò)增PCR，構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18mobsacB-yccA-UKD，通過(guò)自然轉(zhuǎn)化篩選出基因yccA缺失株。
　　在pH6.5，pH7.5和pH8.5的條件下培養(yǎng)JS0135和JS0135ΔyccA，繪制生長(zhǎng)曲線，并探究生物被膜形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失基因yccA后JS0135菌株在弱堿條件下生長(zhǎng)緩慢，生物被膜形成能力減弱，表明基因yccA對(duì)弱堿條件敏感，可能影響細(xì)菌生物被膜形成。JS0135和JS0135ΔyccA銅敏感實(shí)驗(yàn)