仙鶴草抗氧化物質基礎及構效關系研究.pdf

1、隨著自由基醫(yī)學的不斷發(fā)展，人們對氧化應激在疾病發(fā)生、發(fā)展中作用的認識也不斷深入。研究表明氧化應激與癌癥、心腦血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等密切相關。尋找優(yōu)異的抗氧化劑，特別是天然抗氧化劑應用于氧化應激相關疾病的預防與治療已成為臨床醫(yī)學、預防醫(yī)學、藥學等領域的重要課題之一。本課題以薔薇科多年生草本植物龍牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.)的全草——仙鶴草為研究對象，利用天然藥物化學、計算化學、藥理學和現(xiàn)代儀器分析等多

2、學科的理論及方法，重點圍繞仙鶴草提取物及其各極性部位的抗氧化活性、活性部位的化學成分、單體的抗氧化活性及其清除自由基的構效關系和抗氧化活性物質特征指紋圖譜進行了研究。論文研究獲得如下主要結論：
　　 ①以清除DPPH·活性為評價指標，獲得了仙鶴草抗氧化活性物質群的最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)為54.68％、液料比為21.78、提取溫度為74.6℃、提取時間2h，提取次數(shù)3次。
　　 ②采用DPPH·體系、核黃素光照體系、

3、H2O2-Fe2+體系、β-胡蘿卜素/亞油酸體系、紫外線-H2O2-pBR322 DNA體系和BSA-Glu體系，研究了仙鶴草粗提物及各極性部位的清除自由基、抗脂質過氧化、抑制DNA氧化損傷和蛋白質非酶糖基化的活性，結果表明：(1)仙鶴草粗提物具有顯著的清除自由基的活性，對DPPH·、O2-·和·OH的半數(shù)清除濃度(EC50)分別為：6.45、8.94和103.16μg/mL；較強的抗脂質過氧化的活性，抑制β-胡蘿卜素淬滅的半數(shù)抑制濃度

4、(IC50)為10.13μg/mL；較強的抑制蛋白質非酶糖基化的活性，在1.0mg/mL時，其對蛋白質糖基化的抑制率達到了70.33％；一定的抑制DNA氧化損傷斷裂的活性(圖3.6)。(2)仙鶴草提取物抗氧化的主要活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。二者的清除DPPH·、O2-·和·OH的EC50分別為4.88、7.29、63.96μg/mL和5.64、7.66、81.31μg/mL；二者抑制β-胡蘿卜素淬滅的IC50分別為5.42、4

5、.97μg/mL；乙酸乙酯部位表現(xiàn)了顯著的抑制蛋白質非酶糖基化的作用，在1.0mg/mL時，其對蛋白質糖基化的抑制率達到了84.41％；對DNA氧化損傷的保護作用也以乙酸乙酯部位最強。(3)酚類化合物是仙鶴草中的主要抗氧化活性物質群。清除2-·和·OH的活性、抗脂質過氧化活性及抑制蛋白質非酶糖基化活性均與總酚含量顯著相關(p＜0.05)。
　　 ③以分離技術和現(xiàn)代波譜技術等研究手段，從乙酸乙酯部位分離鑒定了23個化合物，包括14

6、個黃酮類化合物：槲皮素、兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷、花旗松素、山奈酚、異牡荊苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、銀椴苷、芹菜素和牡荊苷；2個異香豆素化合物：仙鶴草內(nèi)酯和仙鶴草內(nèi)酯-6-O-葡萄糖苷；7個三萜類化合物：β-胡蘿卜苷、熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸、馬斯里酸、萎陵菜酸和1β，2β，3β，19α-四羥基-12-烯-28-酸。其中花旗松素、牡荊苷、異牡荊苷、熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和馬斯里酸為首

7、次從仙鶴草中分離得到。
　　 ④清除DPPH·的活性研究表明黃酮類化合物為仙鶴草抗氧化活性的主要活性成分。14種黃酮類化合物清除DPPH·活性的強弱順序為：槲皮素＞兒茶素＞金絲桃苷＞蘆丁＞槲皮苷＞木犀草素＞木樨草素-7-O-葡萄糖苷＞花旗松素＞山奈酚＞異牡荊苷＞山奈酚-3-O-葡萄糖苷、銀椴苷、芹菜素、牡荊苷。其中槲皮素、兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷對DPPH·的半數(shù)清除濃度小于10μM，

8、活性優(yōu)于抗壞血酸和2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)，差異顯著(p＜0.05)。首次發(fā)現(xiàn)異牡荊苷清除自由基活性顯著優(yōu)于其苷元芹菜素，即芹菜素C-6成苷可顯著提高清除自由基活性，這可能是提高黃酮類化合物抗氧化活性的又一可選擇的結構修飾途徑。
　　 ⑤采用AM1半經(jīng)驗和密度泛函計算相結合以及多層Oniom計算的量子化學方法，研究了14個黃酮類化合物的O-H解離焓(BDE)和自由基自旋密度，對黃酮類化合物清除自由基活性與結構的關系進行了

9、量子化學理論探討。結果表明：(1)3-OH、B環(huán)上的鄰羥基、2,3-雙鍵和4-羰基的存在可以使自由基的自旋密度分布更加均衡，降低B環(huán)的O-H的BDE，提高化合物清除自由基的活性；(2)黃酮醇3-OH的糖苷化可增大B環(huán)和C環(huán)的夾角，導致自旋密度不均衡性的增加，升高B環(huán)的O-H的BDE，降低化合物清除自由基的活性；(3)黃酮A環(huán)C-6成苷可導致其自由基的自旋密度分布更加均勻，提高自由基的穩(wěn)定性；而C-8成苷可使B環(huán)和C環(huán)的夾角增大，導致離域