SPC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、前言
　　隨著近幾年小鼠基因組操作技術(shù)的發(fā)展和小鼠基因組測(cè)序的完成，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，基因打靶，條件基因打靶以及基因捕獲等技術(shù)在自發(fā)腫瘤小鼠模型的應(yīng)用促使國(guó)內(nèi)外建立了不少肺癌小鼠模型。目前條件基因打靶技術(shù)使用最為廣泛，根據(jù)重組酶的不同分為Cre-LoxP和Flp-Frt系統(tǒng)。借助Cre-LoxP系統(tǒng)條件性敲除目的基因，可以降低某些生存必須基因缺失造成小鼠死亡的風(fēng)險(xiǎn)，另外還可對(duì)基因進(jìn)行特定激活，了解基因的正向作用。目前應(yīng)用于肺癌轉(zhuǎn)基因小

2、鼠模型啟動(dòng)下游序列的啟動(dòng)子可分為兩種:1、組成性表達(dá)啟動(dòng)子，如keratin-5;2、特異性啟動(dòng)子，如肺泡2型細(xì)胞特異表面活性蛋白SPC，Clara細(xì)胞分泌蛋白的啟動(dòng)子CCSP，鈣降素基因相關(guān)肽啟動(dòng)子CGRP。我們以SPC為特異啟動(dòng)子構(gòu)建SPC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用qRT-PCR、westernblot、LacZ染色等方法檢測(cè)Cre重組酶在小鼠的肺泡上皮和支氣管上皮細(xì)胞中的特異表達(dá)。
　　方法
　　1.構(gòu)建SPC-Cre轉(zhuǎn)

3、基因載體。
　　2.轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體SPC-Cre注射片段顯微注射，制備SPC-Cre轉(zhuǎn)基因鼠。
　　3.PCR方法篩選SPC-Cre轉(zhuǎn)基因鼠子代鼠和SPC-Cre;ROSA子代小鼠。
　　4.實(shí)時(shí)PCR，Westernblot檢測(cè)Cre重組酶在SPC-Cre轉(zhuǎn)基因鼠各組織的表達(dá)。
　　5.LacZ染色檢測(cè)SPC-Cre;ROSA小鼠肺泡上皮細(xì)胞中Cre重組酶的活性。
　　結(jié)果
　　1.SPC-Cre轉(zhuǎn)

4、基因載體酶切電泳圖與預(yù)測(cè)相同，測(cè)序顯示Cre片段前成功連接Kozak序列和NLS序列。
　　2.大量繁殖SPC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和SPC-Cre;ROSA小鼠。
　　3.實(shí)時(shí)PCR，Western結(jié)果顯示SPC-Cre轉(zhuǎn)基因鼠肺、腸組織Cre表達(dá)比其他組織高。
　　4.SPC-Cre;ROSA26雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺上皮細(xì)胞有明顯的LacZ染色產(chǎn)生的特異藍(lán)色，Cre重組酶活性較高，其他組織未見特異藍(lán)色。
　　結(jié)論