IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和表型分析.pdf

1、背景:白介素34(Interleukin 34, IL34)是近年來發(fā)現(xiàn)的白介素家族的新成員。它是集落刺激因子受體(Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)的另一個(gè)配體,主要在脾組織表達(dá)。IL34與巨細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor, M-CSF)通過與CSF1R結(jié)合都能刺激骨髓細(xì)胞培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞克隆的形成及維持外周血單核細(xì)胞的生長

2、,但是活化的程度不同?，F(xiàn)在對IL34的研究主要集中在對骨巨細(xì)胞瘤中破骨細(xì)胞的影響和血中對其它細(xì)胞因子的刺激作用,在臨床上M-CSF和CSF1R與各種炎癥和自身免疫病相關(guān)如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎、肺炎、動(dòng)脈粥樣硬化、骨巨細(xì)胞瘤等,所以IL34與這些疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系引起人們的關(guān)注,但對其相關(guān)免疫疾病的研究尚少。目前對于內(nèi)源性IL34對機(jī)體的作用尚未有報(bào)道。因此我們建立白介素34轉(zhuǎn)基因小鼠,為近一步研究高表達(dá)的IL34表達(dá)對小鼠免疫系統(tǒng)的作用和

3、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供模型。方法:把人的IL34基因插入CMV啟動(dòng)子下,構(gòu)建IL34轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射法建立IL34轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型,Western blotting檢測IL34蛋白的表達(dá)水平,組織化學(xué)染色觀察IL34轉(zhuǎn)基因小鼠重要器官的病理改變。結(jié)果:建立了2個(gè)品系的IL34轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)入的人IL34基因在脾臟中的表達(dá)水平高于內(nèi)源性IL34。組織學(xué)分析顯示IL34轉(zhuǎn)基因

4、小鼠各重要器官如腦,心,肝,腎,腸等的形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常,但脾臟的生發(fā)中心比較活躍,白髓的范圍比野生型小鼠大。結(jié)論:建立了IL34轉(zhuǎn)基因小鼠,為研究IL34基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)作用建立了模型。背景心血管病是危害人類健康的最常見疾病。了解有哪些修飾基因調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞從正常的生理狀態(tài)發(fā)展為心肌擴(kuò)張和肥厚,對心肌病發(fā)生機(jī)制具有重要意義。但是,目前對這些基因了解很少。Tomoregulin1是最近發(fā)現(xiàn)的新基因,主要在胚胎生長軸和成體腦神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),參與胚

5、胎生長軸和成體腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在tomoregulin1的研究主要集中在腫瘤,腦的神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等方面,該基因在正常心臟中表達(dá)很低,但我們實(shí)驗(yàn)室的芯片分析提示,在肥厚性心肌病小鼠中表達(dá)較高,有可能是參與心肌肥厚發(fā)病過程的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn)基因。目前沒有該基因?qū)π呐K作用的研究報(bào)道。因此本文特建立過表達(dá)tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細(xì)胞系和心臟特異表達(dá)tomoregulin1的轉(zhuǎn)基因小鼠,以研究tomoregul

6、in1對心肌細(xì)胞和心臟組織的調(diào)節(jié)作用。方法:將tomoregulin1基因插入CMV啟動(dòng)子下游,構(gòu)建tomoreglin1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染建立過表達(dá)tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細(xì)胞系,Western blotting篩選過表達(dá)tomoregulin1基因的H9C2穩(wěn)定細(xì)胞系,繪制細(xì)胞生長曲線觀察tomoregulin1細(xì)胞的生長狀態(tài)和增長速度。BrdU免疫組織化學(xué)法檢測tomoregulin1細(xì)胞的增殖速度。W

7、estern blotting檢測tomoregulinl細(xì)胞的信號通路。將tomoregulin1基因插入心肌特異α-MHC啟動(dòng)子下游,構(gòu)建心臟特異tomoreglinl轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射法建立tomoregulinl轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠,PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型。結(jié)果:將tomoregulin1基因插入pcDNA3.1載體中,構(gòu)建表達(dá)tomoregulin1的表達(dá)載體,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞株建立了穩(wěn)定表達(dá)to

8、moregulin1的細(xì)胞系。Western blotting檢測tomoregulin1的蛋白表達(dá)水平篩選兩個(gè)過表達(dá)tomoregulinl的H9C2細(xì)胞系。通過觀察H9C2和tomoregulinl生長數(shù)繪制的生長曲線顯示,tomoregulinl細(xì)胞的生長速度比H9C2慢。BrdU免疫組織化學(xué)法檢測H9C2細(xì)胞和tomoregulin1細(xì)胞的增殖,發(fā)現(xiàn)tomoregulin1細(xì)胞增殖的速度明顯低于H9C2細(xì)胞,H9C2細(xì)胞BrdU

9、標(biāo)記的陽性細(xì)胞指數(shù)為22％,而tomoregulin1細(xì)胞的陽性指數(shù)只有8%,兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blotting檢測tomoregulin1細(xì)胞內(nèi)的信號蛋白,結(jié)果顯示磷酸化ERK1/2和AKT的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于H9C2細(xì)胞。受體蛋白TGFβreceptorⅠ的表達(dá)量也減少,但是TGFβreceptorⅡ的表達(dá)量卻無明顯改變。在加入cripto蛋白刺激24小時(shí)以后,再提取蛋白做western blot檢

10、測發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK1/2和AKT,TGFβreceptor I,TGFβreceptorⅡ蛋白的表達(dá)量都無差異。通過顯微注射,建立了心臟特異表達(dá)tomoregulin1基因轉(zhuǎn)基因小鼠品系,并通過PCR鑒定tomoregulin1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,共得到4只首建鼠。結(jié)論:tomoregulin1抑制心肌細(xì)胞的生長速度,發(fā)現(xiàn)tomoregulin1通過TGFβreceptorⅠ抑制ERK1/2和AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,實(shí)現(xiàn)對心肌細(xì)胞的生長起到