嗜吞噬細胞無形體自然感染調(diào)查與分離鑒定.pdf

1、無形體自然感染調(diào)查與分離鑒定:
　　一、研究背景
　　嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum,AP),又叫粒細胞無形體(以下簡稱無形體),是一種革蘭氏染色陰性,專細胞內(nèi)寄生菌。該菌主要通過媒介蜱-宿主在自然界中維持,人進入疫源地被帶菌蜱叮咬后可能感染病原體患人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)。該病原體可以引發(fā)牛牧場熱(Pasture fev

2、er)和羊蜱咬熱(Tick-borne fever,TBF),危害畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失(1-2)。自1994年美國實驗室確診第一例HGA以來,發(fā)病呈上升趨勢,1994年～2002年9年共報告發(fā)病人數(shù)為2135例,2003年336例,2004年,538例,2005年700例,2006和2007年均超過500例。1999年美國將該病定為國家法定傳染病。此外在斯洛文尼亞,瑞典、奧地利,西班牙,愛莎維亞等歐洲國家也有病例報道。歐洲牧場熱和蜱

3、咬熱是動物中分布最廣泛的蜱媒傳染病。
　　近年來我國在無形體病流行病學(xué)研究方面已取得了顯著進展。本研究室于1997年在我國首次從大小興安嶺林區(qū)全溝硬蜱檢測到無形體的基因片段。并證實我國東北林區(qū)為HGA潛在疫源地,蜱和野鼠存在無形體自然感染。2006年11月安徽省宣城市某縣出現(xiàn)HGA小爆發(fā),報道了10例疑似HGA病例,其中1例原發(fā)病例死亡,繼發(fā)9病例,懷疑該病原體可能通過人-人傳播;此后河南、浙江和海南等省相繼也有疑似HGA報道。2

4、008年2月衛(wèi)生部印發(fā)《人粒細胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》,要求若發(fā)現(xiàn)HGA疑似或確診病例應(yīng)參照乙、丙類傳染病報告要求于24小時內(nèi)進行網(wǎng)絡(luò)直報;并需全面提高醫(yī)務(wù)人員對HGA的認識,加強預(yù)防控制工作。
　　作為新發(fā)傳染病,我們對HGA及其致病菌的認識還非常局限。有許多亟需解決的問題,如:(1)我們僅對東北地區(qū)媒介蜱種有初步了解,其他大部分地區(qū)情況不明,東北地區(qū)、東南、西南等地區(qū)有待繼續(xù)查明;(2)宿主動物的種類,分布情況如何

5、,公共衛(wèi)生危害怎樣?(3)我國AP遺傳特征、毒力、致病性、宿主傾向性如何?據(jù)此,本課題針對無形體的傳播媒介、宿主動物進行分子流行病學(xué)調(diào)查,在此基礎(chǔ)上進行病原體分離鑒定,擬開展林區(qū)高危人群血清流行病學(xué)調(diào)查。
　　二、研究目的:
　　主要包括:1、闡明我國無形體主要傳播媒介、宿主動物種類、構(gòu)成和感染情況;2、分離培養(yǎng)無形體;3、了解我國不同地區(qū)、不同媒介宿主來源無形體的遺傳進化特征,預(yù)測不同變異株的宿主傾向性及公共衛(wèi)生危害。

6、r>　　三、研究方法
　　1.現(xiàn)場調(diào)查以東北吉林延邊林區(qū)為調(diào)查重點,同時開展包括東北黑龍江林區(qū)、北部內(nèi)蒙古自治區(qū)林區(qū),西北新疆維吾爾族自治區(qū)山林;東南浙江省丘陵地區(qū),西南貴州山區(qū)等5個調(diào)查點的調(diào)查。地形地貌包括森林,高山,丘陵等;跨中溫帶季風(fēng)性海洋氣候,溫帶大陸性季風(fēng)氣候,寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候,亞熱帶濕潤溫和型氣候,兼有高原性和季風(fēng)性氣候以及極端干燥的大陸性氣候等不同氣候條件和生境。
　　2.媒介蜱種類、構(gòu)成及感染情況調(diào)查采

7、用布旗法拖蜱,并從捕獲動物身上檢蜱。請專家進行蜱種鑒定,統(tǒng)計不同地區(qū)蜱的種類組成。用煮沸法提取DNA,PCR擴增特異的AP基因片斷,了解感染率,并進行序列測定和分析。
　　3.宿主動物種類、構(gòu)成及感染情況調(diào)查從調(diào)查點野外用夾夜法或鼠籠捕捉野鼠。鑒定鼠種,計算鼠種群密度。取鼠脾臟研磨成勻漿,提取DNA,擴增特異的AP基因片斷,掌握感染狀況,進行序列測定和分析。
　　4.無形體分離
　　4.1樣品采集
　　經(jīng)過多年調(diào)

8、查發(fā)現(xiàn)東北嚙齒動物均有無形體感染。從該地區(qū)采集樣本,進行無形體分離。
　　4.2用BALB/c鼠培養(yǎng)無形體
　　樣本采集處理后及時經(jīng)腹腔接種小鼠。接種后10天～14天(DPI10～DPI14)采集尾血進行病原體檢測并傳代。
　　4.3細胞培養(yǎng)分離無形體
　　(1)細胞選擇:無形體敏感的人早幼粒細胞(HL60)細胞。
　　(2)細胞培養(yǎng)常用試劑及器材:1640培養(yǎng)基,Gibco胎牛血清,青霉素,鏈霉素,兩性霉

9、素B,進口培養(yǎng)瓶,甩片離心機。
　　(3)實驗步驟:感染小鼠無菌取血100μl～300μl EDTA-K2抗凝血,接種于2×105至6×105 HL60細胞中。5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。3天換液并且檢測細胞感染狀態(tài)。
　　4.4感染狀況檢測鑒定
　　(1)實時定量PCR檢測
　　以無形體特異的主要外膜蛋白2(major surface protein2,msp2)基因片段為靶基因的實時定量PCR檢測。
　

10、　(2)無形體特異rrs,gltA基因PCR擴增
　　實時定量PCR檢測陽性樣本,用無形體特異rrs,檸檬酸鹽合成酶基因(gltA)進行擴增序列分析及病原體鑒定。
　　(3)瑞氏吉姆薩染色
　　感染小鼠采集尾血做血涂片,或收集感染HL60細胞離心并涂片。自然干燥后甲醇固定10 min。然后用瑞氏吉姆薩染液,根據(jù)操作說明染色。顯微鏡下觀察粒細胞內(nèi)或HL60細胞內(nèi)無形體生長情況,10X目鏡*100X物鏡。
　　(4)

11、電鏡觀察
　　采感染動物血液標(biāo)本1大滴(50 ul)1000 rpm離心10 min或離心收集感染HL60細胞。沉淀用預(yù)冷固定液固定2次;用緩沖液(cacodylate buffer)洗3次;然后在1％osmium tetroxide中固定1小時。在逐漸增大濃度的甲醇中脫水,包埋(Epon812);制作超薄切片,染色,鏡檢(PHILIPS TECNAI10 electron microscope)。
　　(5)間接免疫熒光檢

12、測
　?、偈占腥炯毎?PBS洗兩遍,涂片,干燥后用1:1丙酮-甲醇固定10 min,-20℃存放備用。
　?、诟腥狙迨占?感染動物采集血清。56℃滅活。實驗時按照1:20,1:40,1:80倍比稀釋。
　?、坳栃詫φ?美國加州大學(xué)Janet教授提供無形體感染馬血清或PCR陽性感染小鼠血清。
　　④陰性對照:正常馬血清或正常小鼠血清。⑤顯微鏡下觀察
　　5.基因序列分析
　　陽性標(biāo)本PCR擴增glt

13、A基因,msp4基因,groESL基因等。產(chǎn)物純化、序列測定分析比對,用Mega3.0軟件進行遺傳進化分析并繪制遺傳進化樹。
　　四、主要研究結(jié)果:
　　1.我國南北方林區(qū)媒介蜱種類及感染情況
　　2004年-2005年,4月-6月,共采集媒介蜱951只。其中森林革蜱(Dermacentor silvarum)355只:包括游離森林革蜱327只,寄生蜱28只;全溝硬蜱(Ixodes persulctus)169只,游離

14、蜱100只,寄生蜱69只;寄生中華硬蜱(I.sinesis)400只?？偟臒o形體感染率為0.8％。其中森林革蜱0.6％,全溝硬蜱3.5％,血蜱0,中華硬蜱0。全溝硬蜱感染率高于森林革蜱(經(jīng)Fisher精確檢驗,P=0.041),雄性全溝硬蜱感染率高于雌性(經(jīng)Fisher精確檢驗,P=0.011),寄生蜱與游離蜱感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(經(jīng)Fisher精確檢驗,P=0.186)。
　　2.我國南北方林區(qū)宿主動物種類及感染情況
　

15、　本研究于2004年到2007年從6個調(diào)查點共捕獲野鼠705只,20余種。不同地區(qū)鼠種差異較大。通過對從小鼠脾臟提取的DNA進行巢式PCR檢測,發(fā)現(xiàn)有10種以上野鼠存在無形體自然感然,包括黑線姬鼠(A.agrarius),大林姬鼠(A.peninsulae),小林姬鼠(A.sylvaticus),倉鼠(Ricetulus sp.),棕背平鼠(Clethrionomys rufocanus),社鼠(Niviventer confucian

16、us),白腹巨鼠(N.coxingi),黃毛鼠(羅賽鼠)(Rattus losea),褐家鼠(R.norvegicus),小花鼠(Tamias sibiricu)等,平均感染率為5.5％。南北方感染優(yōu)勢鼠種不同。北方黑線姬鼠、倉鼠和大林姬鼠是優(yōu)勢鼠種,東南林區(qū)社鼠和小林姬鼠是優(yōu)勢鼠種。東北黑線姬鼠,倉鼠,大林姬鼠,花鼠,褐家鼠和棕背鼠平鼠等6種鼠有無形體感染;而我國東南社鼠,小林姬鼠,褐家鼠,白腹巨鼠,黃毛鼠(羅賽鼠)等5種屬感染了無形

17、體。
　　黑線姬鼠是我國東北林區(qū)的優(yōu)勢鼠種,AP感染率高達9.9％,大林姬鼠和倉鼠也廣泛活動于我國東北林區(qū),AP感染率分別為5.4％和4.6％;通過05年到09年的長期監(jiān)測,黑線姬鼠、倉鼠和大林姬鼠是優(yōu)勢鼠種并且存在持續(xù)感染。在南方,社鼠和小林姬鼠是優(yōu)勢鼠種,無形體自然感染率分別為5.2％和9.5％。褐家鼠感染率較高,達8.5％,褐家鼠在居民區(qū)廣泛活動,存在較大公共衛(wèi)生隱患。其它一些鼠種,如倉鼠,棕背平鼠,白腹巨鼠,黃毛鼠(羅賽鼠

18、),小花鼠等也有無形體感染,但是由于其所占捕獲鼠種的比例較少,在無形體傳播中的作用有待進一步研究。
　　3.我國無形體分離鑒定
　　本研究通過接種BALB/c小鼠和接種HL60細胞在我國乃至亞洲地區(qū)首次成功分離3株無形體。其中2株來源于嚙齒動物,1株來源于病羊。通過PCR擴增,瑞士-姬姆薩染色,免疫熒光法鑒定,電子顯微鏡觀察及特異序列分析等多種方法鑒定,證實無形體的成功分離。
　　4.基因序列、遺傳進化分析
　　

19、陽性標(biāo)本擴增gltA,msp4,groESL部分片斷并進行基因序列測定及比對分析,東北全溝硬蜱感染無形體序列與不同鼠種及家畜分離檢測的無形體序列相同而與國外報道的AP株不同,屬新的無形體株。東南無形體株核苷酸序列也存在變異,亦為AP變異株,東南野鼠和野兔感染無形體株不同。國外研究報道不同AP株對人的致病性不同。遺傳進化分析我國分離無形體株與美國對人和家畜致病的無形體株不在同一進化枝,又與野生動物感染無形體株不在同一進化枝。我國發(fā)現(xiàn)并成功

20、分離的AP株是否會引起人類疾病以及嚴重程度如何,還有待進一步研究。
　　五、結(jié)論:
　　全溝硬蜱和森林革蜱為當(dāng)?shù)丶竟?jié)優(yōu)勢蜱種,首次確定我國東北林區(qū)全溝硬蜱和森林革蜱存在AP自然感染。
　　南北方優(yōu)勢鼠種不同。我國東北和東南林區(qū)10余種野鼠、野兔、家畜存在、并且持續(xù)存在無形體自然感染。
　　在我國乃至亞洲地區(qū)首次成功分離到3株無形體,分別來源于黑線姬鼠、倉鼠和發(fā)病的羊。多基因序列分析提示東北媒介蜱、嚙齒動物和家畜感

21、染無形體相同,與東南野鼠、野兔感染無形體不同。本研究在我國發(fā)現(xiàn)3株無形體變異株,其遺傳進化分析關(guān)系有別于歐美對人致病和非致病株。我國不同AP的致病性、毒力,宿主傾向性及公共衛(wèi)生危害有待進一步研究。
　　六、意義與創(chuàng)新
　　本研究以點帶面,多點踏查,發(fā)現(xiàn)無形體自然感染主要存在于我國東部地區(qū)。全溝硬蜱、森林革蜱和10余種野鼠、野兔和家畜存在無形體的自然感染。在我國發(fā)現(xiàn)3株新的無形體株。無形體為細胞內(nèi)寄生菌,其分離培養(yǎng)有一定難度。