印楝油體外抑菌活性及其活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定研究.pdf

1、印楝油(neem oil)是印度傳統(tǒng)藥用植物印楝樹(shù)(Azadirachta indica A. Juss)的種子提取物，具有抗寄生蟲(chóng)、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)?、促進(jìn)傷口愈合及抗菌等藥理活性。有關(guān)印楝油抗菌活性的報(bào)道主要集中于對(duì)植物病原菌的研究，且大多是用印楝油原油進(jìn)行的。而有關(guān)印楝油抗動(dòng)物病原菌活性及印楝油抗菌活性物質(zhì)的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定的研究國(guó)內(nèi)外幾乎處于空白狀態(tài)。因此，本研究擬采用生物活性追蹤的研究方法，通過(guò)考察印楝油、印

2、楝油不同溶劑提取部位、印楝油柱層析不同餾分及印楝油活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)和沙門(mén)氏菌(Salmonella sp CMCC(B)50041)三株動(dòng)物病原菌的體外抑菌活性，從中分離出具有抗菌活性的單體物質(zhì)，并對(duì)之進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.印楝油抑菌活性部位的篩選：采用系統(tǒng)溶劑提取法，

3、選用不同極性大小的溶劑石油醚、氯仿和正丁醇對(duì)印楝油進(jìn)行連續(xù)回流提取，并采用瓊脂稀釋法評(píng)價(jià)不同溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的體外抑菌活性。結(jié)果表明印楝油三種溶劑提取物的得率分別是：石油醚提取物為65.30％，氯仿提取物為10.10％，正丁醇提取物為18.80％。其中石油醚提取物得率最高。三者的體外抑菌活性結(jié)果為：石油醚提取物和氯仿提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為50mg/mL,對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC

4、為100mg/mL。正丁醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為25mg/mL，對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的均為50mg/mL。綜合三種溶劑提取物的得率和抑菌效果，本課題擬選擇印楝油石油醚提取物做進(jìn)一步的研究。
　　 2.印楝油石油醚提取物抑菌活性成分的跟蹤分離與純化：利用硅膠柱層析方法對(duì)印楝油石油醚提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，采用試管二倍稀釋法評(píng)價(jià)各餾分對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的體外抑菌活性，并對(duì)抑菌活性較好的餾分采用丙酮重結(jié)晶

5、技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。硅膠柱層析分離得到三個(gè)餾分(A、B和C)，其得率分別為45.94％、19.16％和6.52％。體外抑菌效果表明，餾分A對(duì)三種菌的MIC均為100mg/mL，餾分B和C對(duì)三種菌的MIC均為50mg/mL。由此可見(jiàn)餾分B和C具有較好的抑菌活性，其中餾分B經(jīng)重結(jié)晶分離純化得到兩種白色化合物(化合物1和化合物2)和一白色混合物(混合物3)。
　　 3.印楝油石油醚提取物柱層析餾分丙酮結(jié)晶物的抑菌活性研究：采用微

6、量肉湯稀釋法評(píng)價(jià)化合物1、化合物2和混合物3對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌活性，并繪制化合物1、化合物2和混合物3的體外時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)，旨在研究三種抗菌藥物濃度與殺菌效果之間的關(guān)系。結(jié)果表明：化合物1對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC分別為：20、5和10mg/mL;最低殺菌濃度(MBC)分別為20、20和10mg/mL?；衔?對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC分別為10、10和2.5mg/mL;MBC

7、分別為20、20和20mg/mL?；旌衔?對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC分別為5、10和20mg/mL;MBC分別為10、20和20mg/mL。由此可知：化合物1對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，化合物2對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果最好，混合物3對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)結(jié)果表明化合物1和化合物2均為濃度依賴(lài)型的抗菌藥物，混合物3為時(shí)間依賴(lài)性抗菌藥物。
　　 4.印楝油抑菌活性物質(zhì)的波譜學(xué)分析及結(jié)構(gòu)鑒定：采用紅

8、外波譜、電噴霧電離質(zhì)譜、1H核磁共振、13C核磁共振、無(wú)畸變極化轉(zhuǎn)移增益實(shí)驗(yàn)及二維核磁共振譜等波譜學(xué)分析對(duì)印楝油單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析并鑒定。結(jié)果表明：
　　 化合物1，電噴霧電離質(zhì)譜([M]＋,m/z)：606;分子式C38H70O5；紅外(cm-1):3004.56,659.68,2917.56,2851.72,1466.48,1381.38,717.67(飽和烷基)，1734.79,1182.37,1295.82(-CO-

9、O-),1139(-O-);1H核磁共振(CDCl3,400HZ,d/ppm):0.87(-CH3)，1.29、1.62、1.98、2.32(-CH2-)，4.15為甲氧基上的亞甲基和次甲基氫(-CH2-,-CH-)，5.34為雙鍵上的氫(-CH=CH-)；13C核磁共振(CDCl3,400HZ,d/ppm):173.88為羰基碳，129.67為雙鍵上的碳，68.33為呋喃環(huán)上次甲基碳，65.00為呋喃環(huán)上亞甲基碳，14.06為甲基碳，

10、22.64、24.83、27.15、29.11、31.86、34.07均為亞.甲基碳；1H-1H二維化學(xué)位移相關(guān)譜：dH0.87與dH1.29偶合相關(guān)，dH1.29與dH1.62偶合相關(guān)，dH1.62與dH2.35偶合相關(guān)；1H異核多量子相干譜：dC14.06與dH0.87相關(guān)，dC22.64、29.11、31.86與dH1.29相關(guān)，dC24.83與dH1.62相關(guān)，dC27.15與dH1.98相關(guān)，dC34.07與dH2.35相關(guān)，

11、dC65.00、68.33與dH4.15相關(guān)，dC129.67與dH5.34相關(guān)：1H異核多鍵相關(guān)譜：dH0.87與dC22.64、31.86遠(yuǎn)程相關(guān)，dH1.29與dC31.86、24.83遠(yuǎn)程相關(guān)，dH1.62與dC34.07、29.11,dH4.15與dC68.33、65.00,dH1.98與dC129.67,dH5.34與dC27.15遠(yuǎn)程相關(guān)。綜合分析以上波譜數(shù)據(jù)，化合物1鑒定為9-十八碳烯酸-十六碳酸-3,4-四氫呋喃二酯(

12、9-octadecanoic acid-hexadecanoicacid-3,4-tetrahydrofuran diester)。
　　 化合物2，電噴霧電離質(zhì)譜([M]+,m/z):636;分子式C40H76O5;紅外(鋤-1)：2917.40,2849.33,1471.44,1381.38,717.67(飽和烷基)，1735.84,1182.08,1256.82(-CO-O-)，1139(-O-)；1H核磁共振(CDCl3

13、,400HZ,d/ppm)：0.86(-CH3)，1.25、1.63、2.35(-CH2-)，4.15為甲氧基上的亞甲基和次甲基氫(-CH2-，-CH-);13C核磁共振(CDCl3,400HZ,d/ppm)：173.89為羰基碳，68.45為呋喃環(huán)上次甲基碳，65.05為呋喃環(huán)上亞甲基碳，14.09為甲基碳，22.68、24.90、29.13、31.92、34.11均為亞甲基碳；1H-1H二維化學(xué)位移相關(guān)譜：dH0.86與dH1.25

14、偶合相關(guān)，dH1.25與dH1.63偶合相關(guān)，dH1.63與dH2.35偶合相關(guān)；1H異核多量子相干譜：dC14.09與dH0.86相關(guān)，dC22.68、29.13、31.92與dH1.25相關(guān)，dC24.90與dH1.63相關(guān)，dC34.11與dH2.35相關(guān)，dC65.05、68.45與dH4.15相關(guān)；1H異核多鍵相關(guān)譜：dH0.86與dC22.68、31.92遠(yuǎn)程相關(guān)，dH1.25與dC31.92、24.92遠(yuǎn)程相關(guān)，dH1.6