印楝油體外殺螨活性及其活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定研究.pdf

1、印楝油(neemoil)是印度傳統(tǒng)藥用植物-印楝樹(AzadirachtaindicaA.Juss)的種子提取物，具有抗寄生蟲、抗微生物、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)兒痛龠M傷口愈合等藥理活性。近年來關(guān)于印楝油抗動物體表寄生蟲活性的研究主要集中在牛寄生蜱，對疥螨的生物活性研究較少。為了開發(fā)新型植物源殺螨劑和充分利用我國豐富的印楝資源。本研究探討了印楝油對兔疥螨(Sarcoptesscabieivar.cuniculi)的體外殺螨活性，

2、在此基礎(chǔ)上，采取生物活性追蹤法對印楝油進行了活性部位的篩選研究和活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1.印楝油對兔疥螨幼蟲的離體殺螨活性研究：采用平皿法觀察了在相對濕度(Relativehumidity,R.H)為75％R.H時，不同溫度和介質(zhì)對兔疥螨幼蟲體外存活率的影響。結(jié)果表明，在相對濕度為75％R.H，溫度為25℃，介質(zhì)為液體石蠟或花生油的條件下，兔疥螨幼蟲體外存活率高，24h存活率在90％以上。該條件可作為

3、離體殺螨試驗的環(huán)境條件。 采用浸殺方式觀察了印楝油對兔疥螨幼蟲的離體殺螨活性。結(jié)果表明，未稀釋的印楝油在25.00min內(nèi)殺死所有供試螨蟲，殺螨活性顯著強于濃度為500mg/mL，的天然除蟲菊酯(825.00min，P＜0.01)，與濃度為25mg/mL的阿維菌素相當(dāng)(18.75min，P＞0.05)；印楝油在24h半數(shù)致死濃度為2.908μL/mL；濃度為500、250和125μL/mL的印楝油對兔疥螨幼蟲半數(shù)致死時間分別為0

4、.991、2.176和5.33h，其殺螨活性表現(xiàn)出濃度-時間依賴性。可見印楝油對兔疥螨幼蟲具有顯著的離體殺螨活性。 2.印楝油殺螨活性部位的篩選：采用系統(tǒng)溶劑法對印楝油進行提取分離，并通過離體殺螨試驗篩選活性部位。結(jié)果表明，印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位得率分別為56.82％、25.36％和5.14％。濃度為250μL/mL，時，三種提取物的殺螨活性在作用前期(12h)和后期(20h)無顯著差異；在作用中期(16h)，三者

5、的致死率分別為95.15％、80.28％、83.65％，表現(xiàn)為：石油醚提取物殺螨活性顯著強于氯仿和乙酸乙酯提取物(P＜0.05)，而氯仿提取物和乙酸乙酯提取物兩者差異不顯著。可見印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位都具有較強的殺螨活性，其中石油醚提取部位殺螨活性相對較高，氯仿和乙酸乙酯提取部位殺螨活性相近。 3.印楝油殺螨活性物質(zhì)的跟蹤分離與純化：采用硅膠柱層析法、重結(jié)晶純化技術(shù),結(jié)合離體殺螨試驗對印楝油石油醚和氯仿提取物殺螨活

6、性物質(zhì)進行跟蹤分離與純化。結(jié)果表明印楝油石油醚和氯仿提取物均得四個段位，其中氯仿提取物的段位Ⅲ殺螨活性突出，在濃度為200mg/mL時，4.5h內(nèi)可殺死所有供試螨蟲；對段位Ⅲ用丙酮反復(fù)重結(jié)晶后得一白色雪花狀結(jié)晶物?？梢娪￠蜌Ⅱ钚晕镔|(zhì)主要集中在氯仿提取物的段位Ⅲ中，并從中獲得一種結(jié)晶化合物。 4.單體化合物殺螨活性的測定：采用互補重對數(shù)模型擬合印楝油單體化合物的離體殺螨毒力。結(jié)果表明，印楝油單體化合物殺螨毒力表現(xiàn)出濃度效應(yīng)是時

7、間的相關(guān)函數(shù)，時間效應(yīng)又是濃度的相關(guān)函數(shù)，24h的半數(shù)致死濃度為0.082mg/mL，僅為印楝油的1/33，7.500mg/mL濃度時的半數(shù)致死時間為15.33h?？梢娫搯误w化合物具有很強的離體殺螨活性。 5.單體化合物的波譜分析：采用紅外波譜、電噴霧電離質(zhì)譜、1H核磁共振、13C核磁共振、無畸變極化轉(zhuǎn)移增益實驗及二維核磁共振譜等波譜學(xué)分析對印楝油單體化合物進行結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果表明，電噴霧電離質(zhì)譜([M]+，m/z)：636；分子

8、式C40H76O5；紅外(cm-1)：2917.40，2849.33，1471.44，1381.38，717.67(飽和烷基)，1735.84，1182.08，1256.82(-CO-O-)，1139(-O-)；1H核磁共振(CDCl3，400HZ，δ/ppm)：0.86(-CH3)，1.25、1.63、2.35(-CH2-)，4.15為甲氧基上的亞甲基和次甲基氫(-CH2-，-CH-)；13C核磁共振(CDCl3，400HZ，δ/pp

9、m)：173.89為羰基碳，68.45為呋喃環(huán)上次甲基碳，δ65.05為呋喃環(huán)上亞甲基碳，14.09為甲基碳，22.68、24.90、29.13、31.92、34.11均為亞甲基碳；1H-1H二維化學(xué)位移相關(guān)譜：δH0.86與δH1.25偶合相關(guān)，δH1.25與δH1.63偶合相關(guān)，δH1.63與δH2.35偶合相關(guān)：1H異核多量子相干譜：δC14.09與δH0.86相關(guān)，δC22.68，29.13，31.92與δH1.25相關(guān)，δC2

10、4.90與δH1.63相關(guān)，δC34.11與δH2.35相關(guān)，δC65.05，68.45與δH4.15相關(guān)；1H異核多鍵相關(guān)譜：δH0.86與δC22.68、31.92遠程相關(guān)，δH1.25與δC31.92、24.92遠程相關(guān)，δH1.63與δC34.11、29.13，δH4.15與δC68.45、65.05遠程相關(guān)。該化合物被鑒定為十八-碳酸-四氫呋喃-3，4二酯(Octadecanoicacid-tetrahydrofuran-3,