RSV基因在本氏煙中的表達(dá)及RSV侵染對(duì)灰飛虱免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的水稻條紋葉枯病近年來(lái)在我國(guó)廣大水稻產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行,給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。RSV是纖細(xì)病毒屬(Tenuivirus)的典型成員,病毒基因組由4條ssRNA組成,編碼7個(gè)蛋白,由灰飛虱(LaodelphaxstriatellusFallén)以持久方式傳播。為了探討RSV外殼蛋白(coatprotein,CP)和病害特異性蛋白(disease-specificprotein,SP

2、)基因在真核生物細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量及其功能,本研究利用融合表達(dá)熒光標(biāo)記基因的方法在本氏煙上進(jìn)行了RSVCP和SP基因的瞬時(shí)表達(dá),并采用激光共聚焦觀察了其在煙草葉片表皮細(xì)胞中亞細(xì)胞定位及兩個(gè)蛋白的共定位。此外,為了研究RSV與傳播介體灰飛虱互作過(guò)程中灰飛虱體內(nèi)的免疫反應(yīng),本研究還通過(guò)Real-timePCR分析了灰飛虱體內(nèi)免疫相關(guān)基因mucin表達(dá)量與RSV侵染之間的相關(guān)性。
　　 RSVCP和SP基因分別與GFP基因融合后,構(gòu)建

3、至pCHF3植物雙元表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在本氏煙葉片上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。為了明確GFP基因在表達(dá)載體中的位置對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響,同時(shí)構(gòu)建了pCHF3-CP-GFP、pCHF3-GFP-CP、pCHF3-SP-GFP及pCHF3-GFP-SP融合表達(dá)載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)后,紫外燈下觀察及Western-blot分析表明GFP融合蛋白均得到了有效表達(dá),但GFP在表達(dá)載體中的融合位置對(duì)基因的表達(dá)量無(wú)明顯影響。為了增強(qiáng)目的基因

4、的表達(dá)量,將基因沉默抑制子P19與融合載體共浸潤(rùn)本氏煙,結(jié)果發(fā)現(xiàn)P19能明顯增強(qiáng)GFP的熒光強(qiáng)度,Western-blot結(jié)果也顯示融合蛋白的表達(dá)量明顯增加,表明與基因沉默抑制子共浸潤(rùn)可以增加目的蛋白的表達(dá)量。
　　 為了進(jìn)一步分析CP和SP在本氏煙葉片中的亞細(xì)胞定位,本研究還構(gòu)建了pCHF3-GFP-CP和pCHF3-RFP-SP融合表達(dá)載體。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明CP和SP單獨(dú)浸潤(rùn)時(shí)都主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上

5、。而GFP-CP與RFP-SP共浸潤(rùn)本氏煙后CP和SP的定位有所改變,CP主要定位于細(xì)胞壁上,并呈點(diǎn)狀分布;SP則只在細(xì)胞壁上形成類似內(nèi)含體的結(jié)構(gòu),并與CP存在共定位現(xiàn)象。共同的亞細(xì)胞定位表明CP和SP兩者間可能存在互作。
　　 為了研究傳播介體灰飛虱體內(nèi)與RSV侵染相關(guān)的免疫反應(yīng),本研究根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物RT-PCR擴(kuò)增了灰飛虱體內(nèi)的免疫相關(guān)基因,其中只有mucin能夠得到特異性擴(kuò)增,且無(wú)毒灰飛虱和帶毒灰飛虱體內(nèi)均有muci