RSV基因在本氏煙中的表達及RSV侵染對灰飛虱免疫相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的水稻條紋葉枯病近年來在我國廣大水稻產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行,給水稻生產(chǎn)造成了嚴重損失。RSV是纖細病毒屬(Tenuivirus)的典型成員,病毒基因組由4條ssRNA組成,編碼7個蛋白,由灰飛虱(LaodelphaxstriatellusFallén)以持久方式傳播。為了探討RSV外殼蛋白(coatprotein,CP)和病害特異性蛋白(disease-specificprotein,SP

2、)基因在真核生物細胞中的蛋白表達量及其功能,本研究利用融合表達熒光標(biāo)記基因的方法在本氏煙上進行了RSVCP和SP基因的瞬時表達,并采用激光共聚焦觀察了其在煙草葉片表皮細胞中亞細胞定位及兩個蛋白的共定位。此外,為了研究RSV與傳播介體灰飛虱互作過程中灰飛虱體內(nèi)的免疫反應(yīng),本研究還通過Real-timePCR分析了灰飛虱體內(nèi)免疫相關(guān)基因mucin表達量與RSV侵染之間的相關(guān)性。
　　 RSVCP和SP基因分別與GFP基因融合后,構(gòu)建

3、至pCHF3植物雙元表達載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在本氏煙葉片上進行瞬時表達。為了明確GFP基因在表達載體中的位置對目的蛋白表達量的影響,同時構(gòu)建了pCHF3-CP-GFP、pCHF3-GFP-CP、pCHF3-SP-GFP及pCHF3-GFP-SP融合表達載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行瞬時表達后,紫外燈下觀察及Western-blot分析表明GFP融合蛋白均得到了有效表達,但GFP在表達載體中的融合位置對基因的表達量無明顯影響。為了增強目的基因

4、的表達量,將基因沉默抑制子P19與融合載體共浸潤本氏煙,結(jié)果發(fā)現(xiàn)P19能明顯增強GFP的熒光強度,Western-blot結(jié)果也顯示融合蛋白的表達量明顯增加,表明與基因沉默抑制子共浸潤可以增加目的蛋白的表達量。
　　 為了進一步分析CP和SP在本氏煙葉片中的亞細胞定位,本研究還構(gòu)建了pCHF3-GFP-CP和pCHF3-RFP-SP融合表達載體。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明CP和SP單獨浸潤時都主要定位于細胞核、細胞膜和細胞壁上

5、。而GFP-CP與RFP-SP共浸潤本氏煙后CP和SP的定位有所改變,CP主要定位于細胞壁上,并呈點狀分布;SP則只在細胞壁上形成類似內(nèi)含體的結(jié)構(gòu),并與CP存在共定位現(xiàn)象。共同的亞細胞定位表明CP和SP兩者間可能存在互作。
　　 為了研究傳播介體灰飛虱體內(nèi)與RSV侵染相關(guān)的免疫反應(yīng),本研究根據(jù)相關(guān)序列設(shè)計引物RT-PCR擴增了灰飛虱體內(nèi)的免疫相關(guān)基因,其中只有mucin能夠得到特異性擴增,且無毒灰飛虱和帶毒灰飛虱體內(nèi)均有muci