人apoA Ⅰ基因在巴斯德畢赤氏酵母中的表達研究.pdf

1、人載脂蛋白A Ⅰ(apolipoprotein A Ⅰ,ApoA Ⅰ)分子為243個氨基酸殘基組成的單一肽鏈,分子質(zhì)量為28.3 ku,主要在肝臟中合成,是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的重要組分,無糖基化修飾,具較強的疏水性[1,9].1992年上海醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院研究人員發(fā)現(xiàn)[2]ApoA Ⅰ能特異性地識別肝細胞表面受體.根據(jù)這一特性,可以將人血漿中提取的天然ApoA Ⅰ與卵磷脂、抗腫瘤藥物等

2、重組成復(fù)合物,通過ApoA Ⅰ將藥物靶向運入肝癌細胞,對肝癌細胞有殺傷作用,這一研究已取得初步的成果.用基因工程方法制備ApoA Ⅰ,可克服從人血漿中制備ApoA Ⅰ產(chǎn)量低、步驟多、成本高的缺點,有利于靶向藥物的大規(guī)模生產(chǎn).在之前的實驗中我們在畢赤氏酵母中分泌表達了rApoA Ⅰ,但與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比,其N-末端不均一且C-末端缺失了部分氨基酸.為了解決這兩個問題,我們將除去上游EAEA編碼序列的人工基因apoA Ⅰ<'D>和天然基因apo

3、A Ⅰ<'N>分別插入分泌型載體pPIC9K,將重組的pPIC9K-apoA Ⅰ<'D>和pPIC9K-apoA Ⅰ<'N>用BglⅡ酶切后,轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115和SMDll68菌株,篩選獲得G418高抗性轉(zhuǎn)化子.轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo),上清液用SDS-PAGE與Western blotting檢測,有明顯的rApoA Ⅰ表達,說明去除部分信號肽酶識別序列后,并不影響rApoA Ⅰ的分泌表達,但仍未能解決C-

4、末端降解的問題.所以我們決定嘗試胞內(nèi)表達rApoA Ⅰ的路線:將PCR擴增得到的apoA Ⅰ<'I>基因片段插入胞內(nèi)表達質(zhì)粒pPIC3.5K,重組的pPIC3.5K-apoAⅠ<'I>用BglⅡ酶切后,轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115菌株,篩選獲得G418高抗性轉(zhuǎn)化子,再通過PCR鑒定證實apoA Ⅰ<'I>基因已整合到染色體上.其轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo),收集細胞裂解后,用SDS-PAGE與Western blottin