天然棕色棉纖維葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因Gh3GT的克隆與功能研究.pdf

1、棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物 ,棉纖維是人類日常生活的必需品和紡織工業(yè)的重要原料。彩色棉(colored cotton)又稱有色棉 ,無需加工和染色可直接織成具有天然色彩紡織物,是綠色環(huán)保產(chǎn)品,因此這種棉花又被稱為“生態(tài)棉”。但是天然彩色棉目前存在的共同問題是:產(chǎn)量不高 ,纖維長度短，顏色偏少且色素遺傳不穩(wěn)定，所以培育天然彩色棉新品種 (系) 難度較大。因此，研究棉纖維色素發(fā)育的分子機(jī)理就顯得極為緊迫。但迄今為止，對于棉纖維色素發(fā)育的分子

2、機(jī)理還知之甚少，克隆到的彩色棉纖維中特異表達(dá)的色素基因也為數(shù)不多，還有很多纖維特異或優(yōu)先表達(dá)的色素基因有待克隆和研究，這些工作不僅有助于深入了解棉纖維色素發(fā)育的分子機(jī)理，同時(shí)也可以為基因工程改良彩色棉纖維品質(zhì)和色澤品質(zhì)提供目的基因和理論基礎(chǔ)。
　　 本研究通過抑制性差減雜交方法從棕色棉纖維中克隆了一個(gè)600bp的序列。通過3’RACE和5’RACE技術(shù)克隆到了基因的全長cDNA序列，為1663bp，其開放閱讀框全長1350bp，

3、編碼含450個(gè)氨基酸殘基的蛋白序列。蛋白序列與糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的蛋白序列進(jìn)行比對，此序列C-端具有糖苷轉(zhuǎn)移酶的所有保守氨基酸功能序列PSPG功能域以及N-端的功能基團(tuán)。通過BLAST比對，根據(jù)同源性和保守結(jié)構(gòu)域?qū)⒃摶蛎麨镚h3GT（GeneBank NO.eu921265）。半定量RT-PCR分析表明：該基因在棕色棉纖維中的表達(dá)量明顯高于其他組織及其近等基因系白色棉品種，且其在纖維中的表達(dá)規(guī)律與棕色棉的色素形成過程一致。該基因被定位于

4、葉綠體中。設(shè)計(jì)全長引物，得到了Gh3GT的全長cDNA。構(gòu)建了Gh3GT的植物表達(dá)載體，經(jīng)蘸花轉(zhuǎn)化法侵染了野生型擬南芥，轉(zhuǎn)化了煙草BY-2懸浮細(xì)胞，經(jīng)煙草葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化了野生型煙草。通過Kan的篩選以及提取擬南芥基因組DNA，用PCR的方法證實(shí)得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性植株。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥沒有得到預(yù)想的花色的變化，但其生長速度比野生型明顯緩慢，生育期延長至三個(gè)月左右，且耐旱能力明顯增強(qiáng)，植株大小及花色沒有明顯變化，莖稈變扭曲；而轉(zhuǎn)