Paenibacillus cookii GX-4的β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達、酶學性質研究與分子改造.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纖維二糖中的β-1，4-糖苷鍵，其作用直接影響纖維素的降解效率。β-葡萄糖苷酶被應用于酒類、茶類、飲料等工業(yè)上，取得了巨大的經(jīng)濟效益。近年來β-葡萄糖苷酶逐步的應用于生產白藜蘆醇和大豆異黃酮方面。
　　 本研究構建了本實驗室自行篩選到的P.cookii GX-4的fosmid基因組文庫，文庫約有6000個克隆子。利用篩選平板從文庫中成功的篩選獲得4個具有β

2、-葡萄糖苷酶活性的克隆，對其中2個克隆子進行亞克隆，發(fā)現(xiàn)都含有一個相同的2.3 kb的ORF，對該ORF進行蛋白質結構組件分析，表明該ORF編碼的蛋白質為GH3的β-葡萄糖苷酶，將這個基因命名為Pbgl。利用PCR方法擴增Pbgl克隆到表達載體pSE380上，實現(xiàn)了Pbgl基因在大腸桿菌中表達，通過鎳親和層析對Pbgl進行蛋白純化，并進行了深入的酶學性質研究。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明Pbgl是以單體形式存在，目的蛋白質大小約為84kD

3、a。以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)作為底物，Pbgl的最適反應溫度和pH分別為50℃和8.0，Km與Vmax值分別為0.1754±0.0194 mM和149±3.4 U/mg，葡萄糖抑制常數(shù)IC50值和Ki值分別為177.1mM和34.65 mM。Pbgl能夠水解纖維二糖、乳糖、苦杏仁苷、染料木苷和黃豆苷。本實驗還對Pbgl中與葡萄糖耐受性相關的氨基酸進行了易錯PCR和定點突變研究，共獲得六個正向突變體，分別為Rpbgl、W