Paenibacillus cookii GX-4的β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究與分子改造.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纖維二糖中的β-1，4-糖苷鍵，其作用直接影響纖維素的降解效率。β-葡萄糖苷酶被應(yīng)用于酒類、茶類、飲料等工業(yè)上，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)β-葡萄糖苷酶逐步的應(yīng)用于生產(chǎn)白藜蘆醇和大豆異黃酮方面。
　　 本研究構(gòu)建了本實(shí)驗(yàn)室自行篩選到的P.cookii GX-4的fosmid基因組文庫(kù)，文庫(kù)約有6000個(gè)克隆子。利用篩選平板從文庫(kù)中成功的篩選獲得4個(gè)具有β

2、-葡萄糖苷酶活性的克隆，對(duì)其中2個(gè)克隆子進(jìn)行亞克隆，發(fā)現(xiàn)都含有一個(gè)相同的2.3 kb的ORF，對(duì)該ORF進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件分析，表明該ORF編碼的蛋白質(zhì)為GH3的β-葡萄糖苷酶，將這個(gè)基因命名為Pbgl。利用PCR方法擴(kuò)增Pbgl克隆到表達(dá)載體pSE380上，實(shí)現(xiàn)了Pbgl基因在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)鎳親和層析對(duì)Pbgl進(jìn)行蛋白純化，并進(jìn)行了深入的酶學(xué)性質(zhì)研究。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明Pbgl是以單體形式存在，目的蛋白質(zhì)大小約為84kD

3、a。以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)作為底物，Pbgl的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和8.0，Km與Vmax值分別為0.1754±0.0194 mM和149±3.4 U/mg，葡萄糖抑制常數(shù)IC50值和Ki值分別為177.1mM和34.65 mM。Pbgl能夠水解纖維二糖、乳糖、苦杏仁苷、染料木苷和黃豆苷。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)Pbgl中與葡萄糖耐受性相關(guān)的氨基酸進(jìn)行了易錯(cuò)PCR和定點(diǎn)突變研究，共獲得六個(gè)正向突變體，分別為Rpbgl、W