慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制牛整聯(lián)蛋白亞基αV基因表達(dá)的研究.pdf

1、受體在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用過(guò)程中起著極為重要的作用?？谔阋卟《靖腥舅拗骷?xì)胞的第一步是病毒識(shí)別并結(jié)合存在于宿主細(xì)胞表面的受體，然后在受體的介導(dǎo)下，病毒才能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中完成核酸的復(fù)制及病毒粒子的裝配。整聯(lián)蛋白是一類由α亞基和β亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合形成的異源二聚體跨膜糖蛋白，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，在細(xì)胞的增殖、分化、移行、生長(zhǎng)等許多方面發(fā)揮重要作用。該蛋白家族擁有24個(gè)蛋白成員，其中，αvβ1、αvβ3

2、、αvβ6、αvβ8是目前公認(rèn)的FMDV的受體，這四種整聯(lián)蛋白擁有一個(gè)共同的亞基αv。RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性RNA降解作用。它通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo)，特異性阻抑相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。慢病毒載體是理想的真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移工具，被廣泛應(yīng)用于相關(guān)的RNAi研究領(lǐng)域，例如抗病毒研究、遺傳性疾病的治療、基因治療。利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并整合宿主基因組的特性可以使設(shè)計(jì)好的RNA干擾片段在目的細(xì)胞系中持續(xù)表達(dá)，達(dá)到

3、對(duì)靶基因持續(xù)干擾的效果。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)本課題組以前克隆的牛源整聯(lián)蛋白αv基因(Genban登錄號(hào)：DQ871215)，按照siRNA設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用在線siKNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3個(gè)針對(duì)integrin-αv的siRNA靶點(diǎn)序列αv-2270、αv-1716、αv-483和一個(gè)siRNA陰性對(duì)照si0。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩選出高效的干擾片段αv-483，將αv-483的核苷酸序列交由生物公司合成其對(duì)應(yīng)的雙鏈cDNA，雙鏈c

4、DNA通過(guò)定向克隆連接至U6進(jìn)入載體(U6 entry vector)，構(gòu)建出進(jìn)入載體U6-αv483，U6-αv483與pLenti6/BLOCK-iTTM載.體系統(tǒng)中的表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)LR同源重組反應(yīng)形成表達(dá)載體DEST-αv483。在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的20代次之內(nèi)的293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染DEST-αv483及包裝Mix中的三個(gè)包裝質(zhì)粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG，72h之后收集慢病毒液，命名為plenti6/αv483。用pk-1

5、5進(jìn)行慢病毒滴度的測(cè)定，結(jié)果顯示plenti6/αv483的滴度為14.2×10-6TU/ml，達(dá)到了轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的滴度要求。用plenti6/αv483來(lái)轉(zhuǎn)染牛腎細(xì)胞MDBK，在殺稻瘟菌素的抗性壓力之下篩選出了四株單克隆的陽(yáng)性細(xì)胞系，分別為1B8、1F5、289、2E6。經(jīng)核酸水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和細(xì)胞水平的cell-ELISA及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定，四株細(xì)胞系中整聯(lián)蛋白的表達(dá)量均有不同程度的下降，其中1F5細(xì)胞株中整聯(lián)蛋白表達(dá)量