黃牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定及功能研究.pdf

1、抑制素(inhibin,INH)是由卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞生成和分泌的糖蛋白類激素,是由α-和β-兩個亞基通過二硫鍵連結(jié)而成的異二聚體,其中α亞基是抑制素發(fā)揮生理功能所必需的。抑制素對雌性動物的主要作用是通過抑制促卵泡素(FSH)的合成和分泌而抑制卵泡發(fā)育,促進顆粒細胞的凋亡；對雄性動物的具體作用為抑制精子的發(fā)生,降低睪丸的生精能力。
　　 因此,干擾抑制素α亞基基因的表達,可降低動物體內(nèi)的抑制素水平,進而促進卵泡發(fā)育和精子

2、的生成,提高排卵率。但是,完全干擾抑制素的合成或分泌是否對動物生殖活動及其他生理機能的維持有影響,尚無文獻報道。
　　 本研究選擇INHA基因作為靶基因,分別設(shè)計了7個短發(fā)夾RNA序列(shRNA),采用Gateway克隆技術(shù),分三步構(gòu)建了表達shRNA的慢病毒載體Va、Vb、Vc、Vd、VH1、Vy、Vs,并包裝了表達GFP的慢病毒VGFP進行轉(zhuǎn)染293FT細胞,通過監(jiān)測綠色熒光強度,旨在比較這7種載體及其相互組合的整合能力、

3、干擾效果、物種特異性和介導(dǎo)方式,為闡明抑制素干擾水平與繁殖及其他生理機能維持的關(guān)系,建立適于干擾黃牛和水牛抑制素的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法提供技術(shù)支撐。
　　 結(jié)果如下:
　　 1、適于黃牛的慢病毒載體及其對INH基因表達的抑制率
　　 Va、Vb、Vc、Vd、VH1對黃牛INH基因表達的抑制效果顯著,而陰性對照載體Vy對黃牛INH基因表達無抑制作用。其中Va和Vb對黃牛IHN基因表達的抑制率均在97％以上,具有高效抑

4、制作用；Vc和Vd對黃牛IHN基因表達的抑制率分別為68.36％和82.0％,具有中效率抑制作用；Lvd和VH1對黃牛IHNA基因表達的抑制率分別為28.30％和35.39％,具有低效抑制作用。
　　 2、適于水牛的慢病毒載體及其對INH基因表達的抑制率
　　 Vb、Vc、Vd和Vs對水牛INH基因表達的抑制效果顯著。其中Va、Vb和Vd對水牛INH基因表達,具有高效抑制作用；Vc和Vs對水牛INH基因表達的抑制率分別為

5、69.01％和66.55％,具有中效抑制作用。
　　 3、不同載體組合對INHA基因表達的抑制率
　　 取Va、Vb、Vc、Vd和CH1各100μl,制成混合載體Y后轉(zhuǎn)染黃牛卵巢顆粒細胞,72h后發(fā)現(xiàn)混合物對黃牛INH基因表達抑制效果不明顯。取Va和Vb各250μl制成混合載體E；取Va、Vb和Vc各167μl制成混合載體F；取Va、vb和Vd各167μl制成混合載體H；取Vc和Vd各250μl制成混合載體J；取Va、V

6、b、Vc和Vd制成混合載體N,分別轉(zhuǎn)染水牛卵巢顆粒細胞,72h后發(fā)現(xiàn)E、F、H、J和N對水牛INHA基因表達的抑制效果顯著,其中F、H和J對水牛INHA基因表達的抑制率均在93％以上,具有高效抑制作用；E和N對水牛INHA基因表達的抑制率分別為45.6％和65.13％,具有中效抑制作用。這些結(jié)果說明,載體等量組合后,各自的干擾能力發(fā)生了變化。
　　 4、與質(zhì)粒DNA載體Lvd介導(dǎo)的RNAi效率比較
　　 Lvd對INH基

7、因表達的抑制率為28.30％,遠低于Vd的抑制率82.20％。這說明質(zhì)粒DNA載體介導(dǎo)的RNAi效率低于慢病毒載體。
　　 5、慢病毒載體的整合能力
　　 經(jīng)VGFP轉(zhuǎn)染的293FT細胞培養(yǎng)傳代至39d時,仍可觀察到綠色熒光,且熒光強度沒有明顯減弱,細胞形態(tài)正常,這說明慢病毒載體整合到了宿主基因組且對宿主生長無影響。
　　 結(jié)論:Va、Vb、Vc和Vd能有效抑制黃牛和水牛INHA基因的表達。靶序列同源性較高且位置

8、較近時,干擾效果相近。不同的載體組合對靶基因表達的抑制率不同,靶序列相近的兩個載體組合后,兩載體各自的干擾能力下降；靶序列不同的兩個載體組合后,兩載體各自的干擾能力增強；靶序列相近的兩個載體與一個靶序列不同的載體組合后,三者各自的干擾能力都得到了增強,且隨著靶序列位置差距的增大,增強幅度加大；當(dāng)組合中多于三個載體時,各自的干擾能力都降低,且降低幅度很大。靶序列處在靶基因末端時,即使只有7個堿基匹配也同樣可以發(fā)生干擾。慢病毒載體對靶基因表