RNAi抑制牛朊病毒基因表達(dá)的相關(guān)試驗(yàn)研究.pdf

1、牛海綿狀腦病俗稱瘋牛病，其主要癥狀是患牛精神狀態(tài)失常、共濟(jì)失調(diào)、感覺過敏和中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)空泡化等。瘋牛病給世界的畜牧業(yè)以及人們的生活帶來極大危害，經(jīng)濟(jì)損失慘重。瘋牛病的病原是朊病毒(PrPsc),它是由機(jī)體正常的朊蛋白(PrPc)轉(zhuǎn)化而來，而PrPc是由朊蛋白基因（PRNP）編碼而來，有試驗(yàn)證明PrPc的存在是朊病毒感染的基礎(chǔ)。一方面由于機(jī)體正常的朊蛋白是固定在細(xì)胞膜上的，提取純化較為困難，為了進(jìn)一步在細(xì)胞水平上研究牛朊蛋白的生理生化

2、作用和朊蛋白疾病的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在體外構(gòu)建了表達(dá)PRNP基因的真核表達(dá)載體;另一方面由于RNAi能夠在細(xì)胞中高效特異的降解與其序列同源的mRNA，誘導(dǎo)特定靶基因的沉默，從而達(dá)到實(shí)現(xiàn)基因敲除或敲低的目的，因此，我們可以利用RNAi來敲低牛PrPc的量，從而使牛因缺乏轉(zhuǎn)化的底物而可能具有抵抗朊病毒病的能力。
　　 采用重疊延伸PCR法(SOE-PCR)全基因合成牛PRNP基因的cDNA，并克隆到真核表達(dá)載體pDsRED2-N1中，

3、得到牛PRNP基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，并用800μg/mLG418對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選。結(jié)果顯示通過SOE-PCR成功擴(kuò)增了牛PRNP基因的cDNA，并構(gòu)建成真核表達(dá)載體，得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的BMSC細(xì)胞。
　　 利用RNAi技術(shù)，根據(jù)牛源PRNP基因cDNA設(shè)計(jì)3段siRNA序列和1個(gè)陰性對(duì)照序列，分別將其連接到RNA干擾載體pRNAT-U6.1/Neo上構(gòu)建成shRNA載體，并將shRNA

4、載體轉(zhuǎn)染牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC);通過Real-timePCR和Westernblotting篩選抑制效果最佳的載體，并用800μg/mLG418對(duì)轉(zhuǎn)染最佳載體的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了3個(gè)靶向shRNA載體和1個(gè)陰性對(duì)照shRNA載體;3個(gè)靶向shRNA載體在不同時(shí)間段均在一定程度上下調(diào)了PRNPmRNA的表達(dá)，抑制了朊蛋白PrPc的生成，得到了一個(gè)最佳干擾載體sh3;通過藥物篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh3載體的細(xì)胞單克隆。