轉(zhuǎn)移蛋白酶抑制劑基因RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆的遺傳變異研究.pdf

1、大豆是既是我國(guó)主要的糧食作物，又是主要的油料作物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人類食物和動(dòng)物養(yǎng)殖的主要植物蛋白來(lái)源。但是，大豆含有胰蛋白酶抑制劑、凝集素、脂氧化酶等營(yíng)養(yǎng)抑制因子影響大豆品質(zhì)。胰蛋白酶抑制劑是大豆蛋白質(zhì)中最重要的一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在籽粒中的大量存在，會(huì)明顯影響大豆食品與飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用安全。因此，培育低含量或不含胰蛋白酶抑制劑大豆品種具有重要的意義。但是采用常規(guī)的育種技術(shù)至今尚未能培育出令人滿意的不含胰蛋白酶抑制劑大豆品種，

2、而且進(jìn)程極為緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程的方法對(duì)大豆進(jìn)行有目的的改良，是一種較常規(guī)育種更為有效、快速的方法，是現(xiàn)代生物技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的具體應(yīng)用。 RNA干擾(RNAi)是由同源性內(nèi)源或外源dsRNA引起的序列特異性基因沉默現(xiàn)象，在動(dòng)、植物和真菌中廣泛存在并被證實(shí)。目前已應(yīng)用RNAi技術(shù)在改善油脂的品質(zhì)、改良淀粉品質(zhì)、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或降低有害物質(zhì)含量、提高抗褐化能力、提高果實(shí)耐貯性、進(jìn)行代謝調(diào)控以獲得目的次生代謝

3、物等方面進(jìn)行了作物品質(zhì)改良研究。作為一種下調(diào)表達(dá)技術(shù)，該技術(shù)在研究植物基因功能和改良作物品質(zhì)等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。 本研究是課題組前期工作的繼續(xù)和深入。本課題組為培育低含量或不含胰蛋白酶抑制劑的大豆新品種，已經(jīng)克隆了大豆胰蛋白酶抑制劑基因，并構(gòu)建了高效的RNAi表達(dá)體系，通過(guò)花粉管通道法將其導(dǎo)入大豆，以期抑制大豆胰蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)。本研究在已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因植株TO代種子的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究胰蛋白酶抑制劑RNAi表達(dá)載體對(duì)轉(zhuǎn)基

4、因植株T1代大豆品質(zhì)性狀和農(nóng)藝性狀的影響，以期從變異后代中篩選出有突出優(yōu)點(diǎn)：低含量或不含胰蛋白酶抑制劑，并且綜合性狀優(yōu)良的新種質(zhì)材料。取得如下結(jié)果： 1、將轉(zhuǎn)胰蛋白酶抑制劑RNAi表達(dá)載體的T0代種子第二年種下，對(duì)成株的200株大豆的幼嫩葉片分別提取基因組DNA，以35S啟動(dòng)子的序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從9株植株中得到830bp的特異性擴(kuò)增條帶，而未轉(zhuǎn)化的植株中無(wú)該片段的產(chǎn)生。為進(jìn)一步確定外源基因的整合情況，對(duì)PCR陽(yáng)性植

5、株進(jìn)行PCR-Southern blot分析。結(jié)果表明，9株均有雜交帶出現(xiàn)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株沒(méi)有雜交信號(hào)出現(xiàn)。證明外源基因已整合到基因組中。 2、以T1代的大豆籽粒為材料，采用SDS聚丙烯凝膠電泳對(duì)胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，有5株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照相比有明顯的下降，說(shuō)明外源基因的導(dǎo)入有效地抑制了胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達(dá)。 3、應(yīng)用近紅外谷物分析儀測(cè)定了轉(zhuǎn)基因大豆種子的

6、蛋白質(zhì)和脂肪含量，并將測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)的凱氏定氮法和索氏提取脂肪法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：相同樣品分別用兩種分析方法的測(cè)試結(jié)果基本吻合，尤其是應(yīng)用近紅外谷物分析儀測(cè)定大豆脂肪含量結(jié)果準(zhǔn)確度較高，與索氏提取脂肪法測(cè)定結(jié)果相比，偏差均小于2，最低偏差僅為0.04。以上結(jié)果說(shuō)明近紅外谷物分析儀的分析結(jié)果比較可靠，可以適用于大豆大批量育種材料篩選和非破壞性的品質(zhì)鑒定工作。 4、通過(guò)對(duì)獲得的9株T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和相應(yīng)的對(duì)照植株的脂肪

7、和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，得到5株高脂肪含量的大豆變異株，脂肪含量最高的達(dá)到27.15％，說(shuō)明只有這5株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的RNA干擾構(gòu)件有效地整合到基因組并成功地表達(dá)了siRNA，從而抑制了內(nèi)源性胰蛋白酶抑制劑mRNA的翻譯，使胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達(dá)量明顯降低。這5株植株分別是吉農(nóng)18-32-1-1、吉農(nóng)18-33-1-2、吉農(nóng)18-35-1-1、美引1號(hào)-2-1-1和通農(nóng)14-9-2-1。還得到了一株高蛋白的大豆變異植株通農(nóng)14-6-10，

8、蛋白質(zhì)含量達(dá)到49.89％。 5、通過(guò)對(duì)所有收獲的T1代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓赀M(jìn)行的室內(nèi)拷種結(jié)果，得知9株T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株在農(nóng)藝性狀方面產(chǎn)生了不同類型，不同程度的變異。其中吉農(nóng)18-32-1-1、吉農(nóng)18-33-1-2、吉農(nóng)18-35-1-1、美引1號(hào)-2-1-1和通農(nóng)14-9-2-1的蟲食粒比相應(yīng)的對(duì)照品種增多，因?yàn)橐鹊鞍酌敢种苿?duì)植株本身還有抗蟲保護(hù)作用，所以蟲食粒增多也進(jìn)一步證明這5株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的siRNA有