轉移蛋白酶抑制劑基因RNAi表達載體轉化大豆的遺傳變異研究.pdf

1、大豆是既是我國主要的糧食作物，又是主要的油料作物，具有極高的營養(yǎng)價值，是人類食物和動物養(yǎng)殖的主要植物蛋白來源。但是，大豆含有胰蛋白酶抑制劑、凝集素、脂氧化酶等營養(yǎng)抑制因子影響大豆品質。胰蛋白酶抑制劑是大豆蛋白質中最重要的一類抗營養(yǎng)因子，它在籽粒中的大量存在，會明顯影響大豆食品與飼料的營養(yǎng)價值和食用安全。因此，培育低含量或不含胰蛋白酶抑制劑大豆品種具有重要的意義。但是采用常規(guī)的育種技術至今尚未能培育出令人滿意的不含胰蛋白酶抑制劑大豆品種，

2、而且進程極為緩慢。隨著分子生物學技術的發(fā)展，通過基因工程的方法對大豆進行有目的的改良，是一種較常規(guī)育種更為有效、快速的方法，是現代生物技術在生產實踐中的具體應用。 RNA干擾(RNAi)是由同源性內源或外源dsRNA引起的序列特異性基因沉默現象，在動、植物和真菌中廣泛存在并被證實。目前已應用RNAi技術在改善油脂的品質、改良淀粉品質、提高營養(yǎng)物質或降低有害物質含量、提高抗褐化能力、提高果實耐貯性、進行代謝調控以獲得目的次生代謝

3、物等方面進行了作物品質改良研究。作為一種下調表達技術，該技術在研究植物基因功能和改良作物品質等領域有良好的應用前景。 本研究是課題組前期工作的繼續(xù)和深入。本課題組為培育低含量或不含胰蛋白酶抑制劑的大豆新品種，已經克隆了大豆胰蛋白酶抑制劑基因，并構建了高效的RNAi表達體系，通過花粉管通道法將其導入大豆，以期抑制大豆胰蛋白酶抑制劑基因的表達。本研究在已經獲得轉基因植株TO代種子的基礎上，繼續(xù)研究胰蛋白酶抑制劑RNAi表達載體對轉基

4、因植株T1代大豆品質性狀和農藝性狀的影響，以期從變異后代中篩選出有突出優(yōu)點：低含量或不含胰蛋白酶抑制劑，并且綜合性狀優(yōu)良的新種質材料。取得如下結果： 1、將轉胰蛋白酶抑制劑RNAi表達載體的T0代種子第二年種下，對成株的200株大豆的幼嫩葉片分別提取基因組DNA，以35S啟動子的序列為引物進行PCR擴增，結果從9株植株中得到830bp的特異性擴增條帶，而未轉化的植株中無該片段的產生。為進一步確定外源基因的整合情況，對PCR陽性植

5、株進行PCR-Southern blot分析。結果表明，9株均有雜交帶出現，而未經轉化的植株沒有雜交信號出現。證明外源基因已整合到基因組中。 2、以T1代的大豆籽粒為材料，采用SDS聚丙烯凝膠電泳對胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達進行了測定，結果顯示，有5株轉基因陽性植株的胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達與相應的對照相比有明顯的下降，說明外源基因的導入有效地抑制了胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達。 3、應用近紅外谷物分析儀測定了轉基因大豆種子的

6、蛋白質和脂肪含量，并將測定結果與傳統的凱氏定氮法和索氏提取脂肪法測定結果進行比較。結果表明：相同樣品分別用兩種分析方法的測試結果基本吻合，尤其是應用近紅外谷物分析儀測定大豆脂肪含量結果準確度較高，與索氏提取脂肪法測定結果相比，偏差均小于2，最低偏差僅為0.04。以上結果說明近紅外谷物分析儀的分析結果比較可靠，可以適用于大豆大批量育種材料篩選和非破壞性的品質鑒定工作。 4、通過對獲得的9株T1代轉基因陽性植株和相應的對照植株的脂肪

7、和蛋白質含量的測定，得到5株高脂肪含量的大豆變異株，脂肪含量最高的達到27.15％，說明只有這5株轉基因陽性植株的RNA干擾構件有效地整合到基因組并成功地表達了siRNA，從而抑制了內源性胰蛋白酶抑制劑mRNA的翻譯，使胰蛋白酶抑制劑蛋白的表達量明顯降低。這5株植株分別是吉農18-32-1-1、吉農18-33-1-2、吉農18-35-1-1、美引1號-2-1-1和通農14-9-2-1。還得到了一株高蛋白的大豆變異植株通農14-6-10，

8、蛋白質含量達到49.89％。 5、通過對所有收獲的T1代轉基因植株和非轉基因對照植株進行的室內拷種結果，得知9株T1代轉基因陽性植株在農藝性狀方面產生了不同類型，不同程度的變異。其中吉農18-32-1-1、吉農18-33-1-2、吉農18-35-1-1、美引1號-2-1-1和通農14-9-2-1的蟲食粒比相應的對照品種增多，因為胰蛋白酶抑制劑對植株本身還有抗蟲保護作用，所以蟲食粒增多也進一步證明這5株轉基因陽性植株的siRNA有