犬瘟熱病毒N蛋白C端變異分析及表位ELISA檢測方法的建立.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，死亡率高達50％。該病流行于犬科、鼬科以及浣熊科部分動物，世界范圍內(nèi)分布分布，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)是構(gòu)成CDV核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白且能最早誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，在病毒中表達量最高，具有良好的免疫原性，在CDV的診斷中

2、具有巨大優(yōu)勢。犬瘟熱N蛋白C端存在一個高突變區(qū)(aa408～519)，該區(qū)段變異率較高，具有一定疏水能力且存在大量的潛在抗原表位。有研究發(fā)現(xiàn)C端的變化能夠?qū)Σ《镜亩玖Ξa(chǎn)生影響，且強弱毒株N蛋白的差異也主要體現(xiàn)在C端這一高變區(qū)。因此對該區(qū)域的變異及功能分析有助于我們對CDV的深入研究。
　　為了解犬瘟熱病毒N蛋白C端高變區(qū)具體的變異情況，本研究首先對采自武漢、上海、長春、大連的102份疑似犬瘟熱樣品進行檢測，檢測結(jié)果顯示19份樣品為

3、陽性。對陽性樣品N基因片段進行擴增得到19條序列，與19株GenBank的N基因序列進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在336個核苷酸基因片段中有101個位點發(fā)生突變;在N蛋白C端高變區(qū)112個氨基酸推導(dǎo)序列中，有36個位點發(fā)生改變，N蛋白的C端突變率高達32％，且疫苗株與中國流行株在N蛋白C端存在的差異最大。
　　鑒于上述分析，用腺病毒載體表達的CDV截短N蛋白(aa401-523)免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤

4、細(xì)胞進行融合并篩選到2株能夠穩(wěn)定分泌抗CDV N蛋白的MAb，命名為N1-C8和N1-C41。經(jīng)間接ELISA測定N1-C8和N1-C41培養(yǎng)上清液及小鼠腹水效價分別為1∶1024、1∶106和1∶512、1∶105。Western blot結(jié)果顯示N1-C8和N1-C41兩株MAb在識別CDV的不同毒力毒株上存在差異，可能與CDV強弱毒株在N蛋白上的差異變化有關(guān)。通過肽掃描方法篩選出N1-C8的抗原表位為線性表位440ENQGGDKY

5、PIHFNDE454，但并未能夠篩選出N1-C41的抗原表位，推測可能是因為其抗原表位為空間構(gòu)象型。
　　以篩選出的抗原表位作為包被抗原建立440aa-454aa表位ELISA檢測方法。經(jīng)各項反應(yīng)條件的優(yōu)化最終確定多肽最佳包被濃度為1μg/mL;包被時間為4℃過夜;最佳封閉液為5％脫脂乳;最佳封閉時間為37℃2 h;血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶80;二抗最佳稀倍數(shù)為1∶4000;血清和二抗最佳孵育條件為37℃1h。計算得到陰陽性血清臨界

6、值為0.225;敏感性試驗表明，當(dāng)血清樣品稀釋倍數(shù)為1∶320時仍然能夠檢測出陽性樣品;板內(nèi)重復(fù)性試驗變異系數(shù)CV值在0.42％～8.50％，板間重復(fù)性試驗變異系數(shù)CV值在0.36％～8.92％，均小于10％;選擇MEV、ADV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行特異性試驗，結(jié)果顯示MEV陽性血清OD450nm值為0.207，ADV陽性血清OD450nm值為0.179，均呈陰性。440aa-454aa表位ELISA檢測方法與商品化CDV ELISA試劑盒在