鴨乙肝病毒感染鴨原代肝細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組的研究及DMSO維持鴨原代肝細(xì)胞易感性差異膜蛋白組的初步研究.pdf

1、乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病，中國(guó)有近1.2億人感染，其致病原乙肝病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科。HBV感染具有嚴(yán)格宿主、器官特異性，目前缺乏理想的HBV自然感染細(xì)胞和動(dòng)物研究系統(tǒng)，對(duì)HBV病毒感染過(guò)程特別是早期感染過(guò)程機(jī)制仍然了解很少，與感染過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞蛋白以及病毒感染對(duì)宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)及功能的影響同樣缺乏研究。與HBV具有相似的病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及復(fù)制特點(diǎn)的鴨乙肝病毒(DHBV)，同屬嗜肝DNA病毒；DHBV-鴨原代

2、肝細(xì)胞(PDHs)模型能夠獲得很高感染效率，并可持續(xù)釋放具感染性病毒顆粒，一直是研究嗜肝病毒的重要細(xì)胞和動(dòng)物模型。
　　基于二維電泳(2-DE)和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(MS/MS)的蛋白組學(xué)方法在當(dāng)今生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，既可以研究病毒顆粒上的宿主蛋白，又可研究病毒感染細(xì)胞感染前后的細(xì)胞差異蛋白組，同樣可以研究病毒蛋白對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，其高通量的數(shù)據(jù)為研究病毒與宿主相互作用及病毒感染機(jī)制打下基礎(chǔ)。鴨是禽流感病毒及鴨乙肝病毒的重要宿主

3、，但目前基因組數(shù)據(jù)缺乏；但雞全基因組的測(cè)定和質(zhì)譜技術(shù)特別是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為鑒定鴨蛋白打下基礎(chǔ)。全蛋白組可以整體研究蛋白組分變化情況；組分蛋白組(如親水性蛋白和疏水性蛋白)可使2-DE能夠分析一些低豐度的宿主蛋白。鴨原代細(xì)胞在5％的血清培養(yǎng)基里會(huì)逐漸丟失對(duì)DHBV的易感性，但含1.5％DMSO無(wú)血清培養(yǎng)基可維持其對(duì)DHBV的易感性，目前鴨原代肝細(xì)胞在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)易感性改變機(jī)制未知。
　　本課題擬采用鴨乙肝病毒-鴨原代肝細(xì)胞(D

4、HBV-PDHs)感染細(xì)胞模型，運(yùn)用基于2-DE及MS/MS的方法研究：(1)DHBV感染鴨肝細(xì)胞后蛋白表達(dá)改變情況，研究DHBV病毒感染相關(guān)蛋白；(2)鴨原代肝細(xì)胞在5％血清培養(yǎng)基與在1.5％DMSO無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的差異組分蛋白組(親水性蛋白組分和疏水性蛋白組分即膜蛋白)，研究可能與DHBV易感性相關(guān)的宿主蛋白。并利用生物信息學(xué)的方法對(duì)差異蛋白組的數(shù)據(jù)進(jìn)行功能分類(lèi)以及通路分析，分析差異蛋白在病毒感染過(guò)程中的作用。
　　DHBV

5、感染鴨原代肝細(xì)胞的差異蛋白組顯示，DHBV感染后24、72以及120小時(shí)的鴨原代肝細(xì)胞與未感染病毒鴨原代肝細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白共有75個(gè)差異蛋白點(diǎn)(蛋白表達(dá)變化1.5倍以上)，其中質(zhì)譜鑒定成功51個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)應(yīng)42個(gè)差異蛋白蛋白。差異蛋白主要涉及碳水化合物代謝、細(xì)胞骨架、氨基酸代謝、應(yīng)激反應(yīng)等；通路分析顯示，在碳水化合物代謝差異蛋白中，GAPDH處于蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中心地位，HNF4alpha處于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中心位置，在細(xì)胞骨架差異蛋白中，b

6、eta-actin以及vinculin處于蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中心位置。對(duì)差異蛋白功能分析顯示，DHBV感染鴨原代肝細(xì)胞以后致細(xì)胞碳水化合物代謝和細(xì)胞骨架紊亂，可能利于病毒的復(fù)制和包裝；使谷氨酰胺代謝增強(qiáng)，可能為病毒感染提供替代能量來(lái)源；病毒感染可導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)；并對(duì)一些特定差異蛋白如Elongation Factor2在病毒感染過(guò)程中的作用進(jìn)行了討論。對(duì)差異蛋白annexin A2和beta-actin的差異

7、表達(dá)情況同時(shí)進(jìn)行了蛋白免疫印記驗(yàn)證。
　　為尋找影響DHBV的易感性的宿主蛋白特別是相關(guān)膜蛋白，利用2-DE分析了鴨原代肝細(xì)胞、在1.5％DMSO無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)8天的鴨原代肝細(xì)胞、在5％FBS培養(yǎng)基里培養(yǎng)8天的鴨原代肝細(xì)胞的組分蛋白組(親水性蛋白組分和疏水性蛋白組分即膜蛋白)。組分蛋白基于Trinton X-114對(duì)親疏水性蛋白在溫度變化的情況下溶解度不同原理。目前已完成2-DE預(yù)實(shí)驗(yàn)，為正式實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。
　　綜上所述，

8、本課題首次采用2-DE及串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析了DHBV感染鴨原代肝細(xì)胞在感染后的差異蛋白質(zhì)組，成功鑒定51個(gè)蛋白點(diǎn)、對(duì)應(yīng)為42種蛋白質(zhì)。差異蛋白功能分析顯示，DHBV感染致肝細(xì)胞碳水化合物及細(xì)胞骨架紊亂，使氨基酸代謝增強(qiáng)，并引起細(xì)胞應(yīng)激(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化還原應(yīng)激)，特定蛋白功能分析顯示DHBV可能通過(guò)細(xì)胞Elongation Factor影響宿主蛋白的合成。DMSO影響鴨原代肝細(xì)胞對(duì)DHBV的膜蛋白組已完成預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)膜蛋白組分析鴨原